王惠琳，孟繼龍，張偉偉，張 楠

銀屑病是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫相關(guān)的慢性炎癥性皮膚病，主要以角質(zhì)形成細(xì)胞的異常過(guò)度增殖為特征，因其有著無(wú)法預(yù)知的疾病緩解期及不能完全理解的行為模式，帶來(lái)了嚴(yán)重的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前的研究進(jìn)展表明，CD4+T淋巴細(xì)胞，特別是T輔助（Th）17亞群和調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg）之間的不平衡可能是銀屑病發(fā)展的關(guān)鍵之一，因此Th17/Treg細(xì)胞可能是一種新的治療靶點(diǎn)[1]。國(guó)內(nèi)外已將窄譜中波紫外線（narrow-band ultraviolet，NBUVB）廣泛用于銀屑病的治療，并已取得良好的效果，然而其中的機(jī)制并未完全明了。本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)銀屑病患者及健康對(duì)照者外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的比例，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)患者血清中白細(xì)胞介素（IL）-17及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）的水平。通過(guò)研究NB-UVB治療銀屑病前后Th17/Treg細(xì)胞及其相關(guān)因子的表達(dá)影響，初步探討NB-UVB治療銀屑病的機(jī)制及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例與標(biāo)本

入選2015年10月—2017年8月在本院皮膚科門診就診及住院確診的67例尋常性銀屑病患者，年齡18～60歲，平均年齡25.69歲，病程6個(gè)月～25年，平均病程8.63年。20名正常健康者作為對(duì)照組，年齡18～60歲，無(wú)性別限制。健康對(duì)照組與患者組一般資料比較、性別及年齡上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。采集患者NB-UVB治療前后及健康對(duì)照組外周血標(biāo)本。

1.1.1 入選標(biāo)準(zhǔn) ①所有患者均符合《中國(guó)臨床皮膚病學(xué)》[2]診斷標(biāo)準(zhǔn)，均為進(jìn)行期患者，其中58例經(jīng)過(guò)組織病理檢查確診。②皮損面積＞10%及銀屑病皮損面積及嚴(yán)重度指數(shù)（PASI）評(píng)分≥10分的中、重度尋常性銀屑病入組。③所有患者入選時(shí)1個(gè)月內(nèi)未接受過(guò)局部外用藥，3個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)使用過(guò)免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素和維A酸等藥物治療，無(wú)其他免疫性皮膚病及肺、肝、腎等系統(tǒng)性疾病。④已簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①患者有光敏性皮膚病或有因陽(yáng)光照射后加重或誘發(fā)的疾病等。②孕婦及哺乳期婦女。③有精神、神經(jīng)疾病患者。④近1月內(nèi)服用過(guò)光敏性藥物者。⑤因某些原因未能完成治療方案及隨訪的患者。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 NB-UVB治療使用上海Sigma公司窄譜中波紫外線光療儀（SS-05），波長(zhǎng)為310～315 nm，峰值311 nm，全身照射。照射前充分暴露皮損部位，面部及外生殖器部位覆蓋遮擋，照射距離15～30 cm。采用SUV-1000日光紫外線模擬測(cè)定患者皮膚NB-UVB的最小紅斑量（minimal erythema doses，MED），確定首次劑量為MED平均值的70%，即0.3 J/cm2,每周3～5次，后續(xù)光療劑量在前次劑量基礎(chǔ)上按局部皮膚反應(yīng)依次遞增10%～50%，至光療區(qū)皮膚出現(xiàn)淡紅斑時(shí)則維持該劑量進(jìn)行治療。治療過(guò)程中若出現(xiàn)疼痛性紅斑或水皰時(shí)停止光照，至皮損恢復(fù)后再繼續(xù)照射，此時(shí)劑量為前次劑量的50%，最大劑量為2.0 J/cm2，20次為1個(gè)總療程，若照射過(guò)程中患者痊愈，則延長(zhǎng)照射間隙（每周1～2次），直至療程結(jié)束。

1.2.2 主要儀器及試劑 CANTO-I，PerCP-CyTM5.5 mouse anti-human CD3，F(xiàn)ITC mouse anti-human CD4，APC mouse anti-human CD25，PE mouse anti-human CD127，APC mouse anti-human CD183，PE mouse anti-human CD196（CCR6），紅細(xì)胞裂解液、 細(xì)胞固定破膜液、人淋巴細(xì)胞分離液等（美國(guó)，BD）；ELESA試劑盒（美國(guó)，eBioscience）等。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17/Treg 肝素鈉真空抗凝采血管取人外周血全血1～2 ml，4 ℃放置，8 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)；Th17細(xì)胞樣本管各加入200 μl抗凝全血，后 加 入 5 μl PerCP-Cy?5.5 mouse anti-human CD3，5 μl FITC mouse anti-human CD4，5 μl APC mouse anti-human CD183，5 μl PE mouse anti-human CD196避光孵育30 min，同時(shí)設(shè)置同型對(duì)照管，進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志染色。 孵育后進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，然后洗滌細(xì)胞，每管加入300 μl緩沖液充分混勻細(xì)胞，可上機(jī)檢測(cè)，界定CD3+CD4+CD183-CD196+為Th17細(xì)胞。Treg細(xì)胞樣本管分別加入200 μl 抗凝全血,向樣本管加入 5 μl FITC mouse anti-human CD4，APC mouse anti-human CD25，5 μl PE mouse anti-human CD127，同時(shí)設(shè)置同型對(duì)照管，避光孵育30 min，進(jìn)行細(xì)胞表面染色標(biāo)記。孵育后裂解紅細(xì)胞，洗滌細(xì)胞后離心棄上清，取300 μl緩沖液混勻細(xì)胞可上機(jī)檢測(cè)，界定CD4+CD25+CD127+為Treg細(xì)胞。

1.2.4 ELISA檢測(cè)IL-17和TGF-β1濃度 非抗凝管采空腹靜脈血3 ml，3 000 r/min，10 min分離上清液，并置于離心管中，-70℃保存，備用，避免反復(fù)凍融，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相關(guān)性分析采用Person相關(guān)分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銀屑病患者和健康對(duì)照者外周血 Th17/Treg 細(xì)胞比例檢測(cè)

尋常性銀屑病患者NB-UVB治療前外周血Th17細(xì)胞比例及Th17/Treg比值明顯高于健康對(duì)照組（P

2.2 銀屑病患者和健康對(duì)照者外周血 IL-17 和TGF-β水平

圖1 Th17細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖

表1 外周血Th17細(xì)胞及Treg細(xì)胞比例及Th17/Treg水平比較 （±s，%）

表1 外周血Th17細(xì)胞及Treg細(xì)胞比例及Th17/Treg水平比較 （±s，%）

注：與健康對(duì)照組比較，*P＜0.01；與治療后比較，#P＜0.01

組 別 例數(shù) Th17 Treg Th17/Treg健康對(duì)照組 20 6.23±2.43 8.09±3.64 0.85±0.30銀屑病組治療前 67 12.61±4.41*# 4.83±1.92*# 3.33±2.08*#銀屑病組治療后 67 7.93±2.56 7.34±2.53 1.16±0.44

尋常性銀屑病患者NB-UVB治療前IL-17血清水平明顯高于健康對(duì)照者（P＜0.01），血清TGF-β1水平較健康對(duì)照者明顯低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。尋常性銀屑病患者NB-UVB治療后血清IL-17及TGF-β1水平與健康對(duì)照者相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。＜0.01），外周血Treg細(xì)胞比例明顯低于健康對(duì)照組（P＜0.01）。尋常性銀屑病患者NB-UVB治療后外周血Th17細(xì)胞比例及Th17/Treg比值明顯低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），外周血Treg細(xì)胞比例較治療前明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。尋常性銀屑病患者NB-UVB治療后外周血Th17、Treg細(xì)胞比例及Th17/Treg比值與健康對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1、圖2，表1）

表2 外周血IL-17 和TGF-β1水平比較（±s，pg/ml)

表2 外周血IL-17 和TGF-β1水平比較（±s，pg/ml)

注：與健康對(duì)照組比較，*P＜0.01；與治療后比較，#P＜0.01

組 別 例數(shù) IL-17 TGF-β1健康對(duì)照組 20 20.44±2.63 13.13±3.24銀屑病治療前 67 62.75±24.25*# 9.76±3.03*#銀屑病治療后 67 34.15±15.76 12.00±3.13

2.3 尋常性銀屑病患者PASI評(píng)分與Th17、Treg細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)性分析

本研究中尋常性銀屑病患者PASI評(píng)分為（17.28±5.23）分，與外周血Th17比例、IL-17血清水平、Th17/Treg比例呈正相關(guān)性，r值分別是0.708，0.725，0.794，P值均＜0.01；PASI評(píng)分與Treg細(xì)胞比例、TGF-β1血清水平呈負(fù)相關(guān)性，r值分別是-0.508，-0.612，P值均＜0.01。

3 討論

圖2 Treg細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖

銀屑?。╬soriasis）是一種由多基因遺傳決定的、多環(huán)境因素誘導(dǎo)的免疫異常性皮膚病，嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量及心理健康，關(guān)于銀屑病發(fā)病機(jī)制和治療的研究始終是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)之一。銀屑病發(fā)病原因復(fù)雜，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新型Th細(xì)胞亞群及其細(xì)胞因子在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用得到了廣泛的關(guān)注[3]。Th17細(xì)胞由初始CD4+T淋巴細(xì)胞分化而來(lái)，Th17細(xì)胞在防御胞外菌感染、介導(dǎo)慢性炎癥和腫瘤發(fā)病中發(fā)揮重要作用。Th17產(chǎn)生IL-17、IL-6、IL-22及腫瘤壞死因子（TNF）-α等細(xì)胞因子，Th17常通過(guò)這些細(xì)胞因子形成復(fù)雜的免疫通路網(wǎng)絡(luò)來(lái)發(fā)揮其作用。Th17主要效應(yīng)因子IL17能夠刺激角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子及其他前炎癥遞質(zhì)從而使IL-17A成為免疫系統(tǒng)維持慢性炎癥的關(guān)鍵所在[4,5]。眾多研究結(jié)果顯示，Th17/IL-17在銀屑病發(fā)病機(jī)制及銀屑病炎癥性皮損的發(fā)生中起著重要的作用。與Th17細(xì)胞功能相反卻又相互關(guān)聯(lián)的另一個(gè)重要的細(xì)胞即調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg），Treg可分為兩種類型：自然細(xì)胞（tTreg），誘導(dǎo)細(xì)胞（iTreg），tTreg主要通過(guò)直接的細(xì)胞間接觸發(fā)抑制功能，代表大部分穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)下的Treg細(xì)胞； iTreg主要通過(guò)分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1等發(fā)揮作用[6]。研究表明，數(shù)量及功能的不足導(dǎo)致Treg細(xì)胞不能發(fā)揮其抑制抗原特異性CD4+T淋巴細(xì)胞增殖，不能優(yōu)化輔助性T淋巴細(xì)胞亞型，諸如Th1/Th17 / Th22的分化，同時(shí)Treg細(xì)胞的監(jiān)視功能消弱，使其不能發(fā)揮抑制炎性細(xì)胞的過(guò)度分化作用，這提示Treg細(xì)胞參與了諸如銀屑病、特應(yīng)性皮炎等炎癥性皮膚病及皮膚腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[7]。Th17細(xì)胞主要促進(jìn)炎癥及免疫反應(yīng)，而Treg細(xì)胞主要是抑制免疫和免疫耐受，但這兩種功能相反的細(xì)胞在不同的條件下又能夠相互轉(zhuǎn)化、相互支持，由此形成二者之間平衡的改變，在銀屑病發(fā)病機(jī)制的研究中越來(lái)越受到人們的重視。

筆者的研究結(jié)果顯示，尋常性銀屑病患者外周血Th17細(xì)胞比例及血清中IL-17的表達(dá)水平較正常人明顯升高；外周血Treg細(xì)胞的比例及血清中TGF-β1的表達(dá)水平明顯低于正常人。尋常性銀屑病患者與健康對(duì)照者相比，Th17/Treg細(xì)胞比例明顯增高，同時(shí)Th17細(xì)胞比例及IL17水平的改變與尋常性銀屑病患者PASI評(píng)分呈正相關(guān)，而Treg細(xì)胞比例及TGF-β1的表達(dá)水平與PASI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果提示Th17/Treg二者平衡的失?？赡軈⑴c了銀屑病的發(fā)病及進(jìn)展。目前，通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)及促進(jìn)免疫耐受的途徑來(lái)調(diào)控Th17/Treg及其細(xì)胞因子的異常表達(dá)的治療，可能會(huì)為銀屑病提供靶向治療的思路[8,9]。

NB-UVB目前已普遍用于尋常性銀屑病、白癜風(fēng)等皮膚疾病治療。NB-UVB治療機(jī)制是直接誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的凋亡，增加銀屑病皮損處T淋巴細(xì)胞在局部的消耗，抑制表皮朗漢斯細(xì)胞的數(shù)量及功能，抑制淋巴細(xì)胞的增殖及NK細(xì)胞的活性，抑制免疫反應(yīng)而達(dá)到治療目的[2,10]。本研究結(jié)果顯示，尋常性銀屑病患者使用NB-UVB治療后外周血Th17細(xì)胞比例、 Th17/Treg、IL-17的水平均較治療前明顯降低（P＜0.01），而Treg細(xì)胞比例、TGF-β1水平較治療前明顯增高（P＜0.01）。這提示NB-UVB治療可能通過(guò)調(diào)整外周循環(huán)中Th17及Treg細(xì)胞的數(shù)量及功能來(lái)治療尋常性銀屑病。既往的研究結(jié)果提示，NBUVB的治療能夠減少炎性因子如IL-1、IL-2、IL-6等產(chǎn)生，同時(shí)促進(jìn)抗炎性因子IL-10產(chǎn)生[10]。近年有學(xué)者研究結(jié)果顯示，NB-UVB通過(guò)減少循環(huán)中Th1、Th17細(xì)胞的數(shù)量及抑制其免疫反應(yīng)，上調(diào)具有免疫抑制作用的Treg細(xì)胞的水平數(shù)量及增加其免疫反應(yīng)，通過(guò)抑制促炎性因子IL-17的產(chǎn)生并增加抗炎性因子TGF-β1表達(dá)水平，從而改變CD4+T淋巴細(xì)胞亞群分化而達(dá)到治療尋常性銀屑病的目的[11]。

綜上所述， Th17和Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)及功能的異常在尋常性銀屑病的發(fā)病及病情進(jìn)展中可能起著關(guān)鍵作用。NB-UVB通過(guò)抑制Th17的數(shù)量及功能，恢復(fù)Treg細(xì)胞的表達(dá)及抑制免疫反應(yīng)功能，從而成為治療尋常性銀屑病的一種安全有效的方法。然而，尋常性銀屑病患者Th17/Treg失衡的具體機(jī)制，NB-UVB改變外周血中Th17及Treg數(shù)量及相關(guān)細(xì)胞因子水平的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步的深入研究。