李曉潔，曾百慧，陳慕蘭，郭毓菲，張?jiān)娙?福，吳 鵬*

（黃岡師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃岡 438000）

茯苓（Poria cocos）別稱茯苓塊、茯苓皮，屬真菌界，多孔菌科[1-2]。它作為滲濕利水的藥物，有消腫、安神和提高人體免疫力等功能[3-4]，茯苓多糖是茯苓的重要成分，不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有機(jī)溶劑，在防輻射和抗衰老方面有一定的療效[5]，其中酸性茯苓多糖占其多糖總量的80%以上。當(dāng)前，人們對(duì)茯苓多糖的研究已經(jīng)越來(lái)越深入，不再僅僅滿足于其基本功效，國(guó)內(nèi)利用它抗腫瘤、增加免疫力的功效[6]，國(guó)外利用其功效，將其作為抗癌劑，投入市場(chǎng)[7]。然而，雖說(shuō)對(duì)茯苓多糖的研究已經(jīng)取得了很大的突破，但還是存在茯苓多糖提取效率低、成本高、活性機(jī)理研究尚不清楚等問(wèn)題。

提取茯苓多糖[8]的方法有很多，有復(fù)合酶法[9]、熱水浸提法[10]、微波輔助提取法[11]及發(fā)酵法[12]等。復(fù)合酶法提取效果較好，但對(duì)于各種酶之間的協(xié)同效應(yīng)以及最優(yōu)酶解條件要求極高；熱水浸提法和發(fā)酵法時(shí)間長(zhǎng)且提取率都較低；微波輔助提取法提取率高，但需控制溫度及時(shí)間。本研究采用堿提法提取茯苓多糖，操作容易，成本低廉，適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。選擇料液比、堿濃度、堿提時(shí)間為影響因素，通過(guò)單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)茯苓多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在探索酸性茯苓多糖的最佳提取工藝，為更好的利用茯苓多糖提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯苓：市售；氫氧化鈉（分析純）、碳酸氫鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；乙二胺四乙酸（分析純）鹽酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；C21-SK2103多動(dòng)能電磁爐：廣東美的生活電器制造有限公司；101-2A型電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；DFT-200C高速萬(wàn)能粉碎機(jī)、FDU-1200真空冷凍干燥機(jī)：上海比朗儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市順華儀器有限公司；PH-10力辰科技筆式酸度計(jì)：杭州試三科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茯苓多糖提取工藝流程[13]及操作要點(diǎn)

茯苓粉的制備→堿液浸提→中和→離心→取沉淀透析→離心→取沉淀真空冷凍干燥→茯苓粗多糖

茯苓粉的制備：選用無(wú)斑點(diǎn)、無(wú)蛀蟲的茯苓，經(jīng)清水洗凈后放入電磁爐中煮熟，將煮熟的茯苓烘干（50℃、24 h）、經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過(guò)50目篩[14]得茯苓粉，封存，備用。

堿液浸提：稱取1 g茯苓粉放入燒杯，分別按照一定的料液比加入一定濃度的NaOH溶液，在4℃[13]恒溫水浴鍋中浸提一定時(shí)間。

中和：將堿液浸提多糖溶液用0.5 mol/L的HCl進(jìn)行中和，使pH值為7，避免多糖在稀堿條件下發(fā)生水解。

離心：將中和后的溶液在8000r/min條件下離心10min，去除濾液，得到多糖沉淀。

透析：多糖沉淀進(jìn)行透析，其目的是將NaCl去除，24 h內(nèi)需要置換2～3次自來(lái)水，在低溫條件下透析7 d。

離心：在8 000 r/min條件下離心10 min，去除水分，得到多糖沉淀。

真空冷凍干燥：多糖沉淀在-60～-50℃溫度條件下，真空冷凍2 h，在-50～10℃溫度條件下冷凍干燥10 h，即可得到茯苓粗多糖。

1.3.2 提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

取1 g茯苓粉，按照不同料液比1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶60（g∶mL），加入不同濃度（0.3 mol/L、0.4 mol/L、0.5 mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L）的NaOH溶液，在恒溫水浴鍋中進(jìn)行浸提不同時(shí)間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h），浸提后的溶液用0.5 mol/L的HCl中和，使得混合體由透明水狀變?yōu)榘胪该黟こ頎睿? 000 r/min離心10 min，取沉淀。將沉淀放入透析袋中，在水中透析7 d，透析完畢后，離心出盡可能多的水，最后通過(guò)真空冷凍干燥進(jìn)一步去除粗多糖中的水，使黏稠狀的多糖變?yōu)榧堎|(zhì)狀的多糖。稱取多糖質(zhì)量并計(jì)算粗多糖提取率，其計(jì)算公式如下：

1.3.3 提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)[15]

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)中心組合試驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，以料液比（A）、堿液濃度（B）和堿提時(shí)間（C）為響應(yīng)因子，茯苓粗多糖的提取率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)提取率的影響

圖1 料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effect of material to liquid ratio on polysaccharides extraction rate

由圖1可以看出，料液比對(duì)多糖提取效果非常明顯，提取效果基本呈直線變化。料液比為1∶40～1∶55（g∶mL）時(shí)，多糖提取率由60.4%上升至68.9%，此階段提取率上升趨勢(shì)明顯；當(dāng)料液比為1∶55（g∶mL）時(shí)，多糖提取率最大，為68.9%；當(dāng)料液比＞1∶55（g∶mL）之后，多糖提取率趨于穩(wěn)定。因此，選擇料液比1∶55（g∶mL）為宜。

2.1.2 堿液濃度對(duì)提取率的影響

圖2 堿濃度對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of alkali concentration on polysaccharides extraction rate

由圖2可以看出，隨著堿液濃度的增加，茯苓多糖提取率也增加，在堿液濃度為0.5 mol/L時(shí)，多糖提取率為75.8%達(dá)到峰值，在堿液濃度＞0.5 mol/L之后，茯苓多糖的提取率開始下降。多糖的提取大多都是采用稀堿溶液提取，因?yàn)檫@樣有利于使多糖中的不溶性纖維素、半纖維素等與果膠多糖之間的鍵斷裂，從而提高多糖產(chǎn)率，而堿液濃度過(guò)高的話，會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)，反而不利于提取，而且堿濃度過(guò)高，需要更多的酸來(lái)進(jìn)行中和，成本也會(huì)增加。因此，NaOH溶液濃度0.5 mol/L為宜。

2.1.3 堿提時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖3 堿提時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of alkali extraction time on polysaccharides extraction rate

由圖3可以看出，堿提時(shí)間為0.5～1.0 h時(shí)多糖提取率逐漸升高，并且多糖提取率在堿提時(shí)間為1.0 h時(shí)達(dá)到最大值，為73.8%，而堿提時(shí)間為1.0～2.5 h時(shí)，提取率開始下降，分析原因是反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，茯苓中的多糖在堿性環(huán)境中結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，導(dǎo)致降解，因此多糖提取率下降。因此，堿提時(shí)間1.0 h為宜。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化茯苓多糖的提取工藝[16]

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)酸性茯苓多糖的提取的3個(gè)顯著影響因素進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)分析，以茯苓粗多糖的提取率（Y）為響應(yīng)值，3個(gè)影響因素包括料液比（A）、堿濃度（B）、堿提時(shí)間（C），響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果與分析見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface experiments design

參照表2進(jìn)行試驗(yàn)，軟件分析響應(yīng)值是酸性茯苓多糖的提取率，利用Design-Expert軟件對(duì)表2進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到回歸方程[17-18]：

對(duì)模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，此回歸方程P＜0.05，說(shuō)明該模型顯著，失擬項(xiàng)P值為0.050 9＞0.05，不顯著，表明回歸方程具有顯著意義。且該模型相關(guān)系數(shù)R2=0.868 9，說(shuō)明該回歸方程可以很好地顯現(xiàn)料液比、堿液濃度、堿提時(shí)間與提取率之間的真實(shí)關(guān)系。由表3還可以得出，模型中因素B對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）、二次項(xiàng)B2交互項(xiàng)BC均對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），而因素A、C；二次項(xiàng)A2、C2；交互項(xiàng)AB、AC對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）；3個(gè)因素茯苓多糖提取率影響順序?yàn)锽＞A＞C，即堿液濃度＞料液比＞堿提時(shí)間。

2.2.2 響應(yīng)面分析

各因素的交互作用對(duì)茯苓多糖提取率影響的響應(yīng)面及等高線如圖4所示。

圖4直觀的反映了影響酸性茯苓多糖提取率的3個(gè)因素兩兩交互作用，隨著料液比、堿液濃度和堿提時(shí)間的增加，提取率的含量呈先升高后下降的趨勢(shì)，在所采用的數(shù)值間均有極值出現(xiàn)。沿料液比（A）方向比堿提時(shí)間（C）的響應(yīng)面坡度的坡度更陡，等高線也更密集，說(shuō)明料液比對(duì)酸性茯苓多糖提取率的影響大于堿提時(shí)間，與方差分析結(jié)果一致；等高線呈扁平狀則表示兩因素交互影響較大，堿液濃度（B）對(duì)酸性茯苓多糖提取率的影響大于堿提時(shí)間（C），且兩因素交互作用明顯，符合方差分析的結(jié)果。

圖4 料液比、堿液濃度和堿提時(shí)間對(duì)多糖提取率交互影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between material to liquid ratio,alkali concentration and alkali extraction time on polysaccharides extraction rate

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由上述響應(yīng)面分析法求得的最佳條件為料液比1∶50，堿濃度0.6 mol/L，堿提時(shí)間1.06 h，理論最佳茯苓多糖提取率為78.6%，考慮在實(shí)際操作上的方便性，將各因素修正為料液比1∶50（g∶mL），堿液濃度0.6 mol/L，堿提時(shí)間1.0 h，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，通過(guò)3次平行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)實(shí)際提取率平均值為78.5%，與回歸方程預(yù)測(cè)值78.6%基本吻合，所以該結(jié)果有效。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探索茯苓多糖的提取方法，為進(jìn)一步優(yōu)化酸性茯苓多糖的提取工藝提供新的參考。相關(guān)資料表明，堿濃度顯著影響茯苓多糖的提取效果，在查閱了多篇文獻(xiàn)并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)后得出了三個(gè)較為顯著的影響因素，因此選用堿濃度、堿提時(shí)間、料液比三個(gè)單因素進(jìn)行單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)，得出料液比1∶50（g∶mL），堿液濃度0.6 mol/L，堿提時(shí)間1.0 h，多糖提取率達(dá)到78.5%，為提取酸性茯苓多糖提供了更加快速有效的方法。