羅小葉，胥思霞，邱樹毅，吳 海，王曉丹*

（1.貴州大學 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；3.青酒集團有限公司，貴州 黔東南 556000）

中國白酒大曲中含有豐富的微生物菌系和酶系，菌系包括細菌、霉菌、酵母，酶系包括糖化酶、淀粉酶、蛋白酶和酯化酶等。大曲中的酯化酶可使酸和醇催化生成相應的酯類物質(zhì)[1]，酯類物質(zhì)是白酒中所占比例最大的香味物質(zhì)，主要包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯，稱為四大酯類[2]，濃香型白酒以己酸乙酯為主體香，與乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯一起構(gòu)成復合香氣，因此這些酯類物質(zhì)與白酒發(fā)酵過程中所用的大曲有很大關(guān)系，白酒風格的形成與所用的大曲也息息相關(guān)[3]。

酯化酶產(chǎn)生菌是體現(xiàn)具有酸醇酯化能力特殊功能的特定微生物，用酯化酶合成己酸乙酯研究最多的是霉菌。傳統(tǒng)的固態(tài)濃香型大曲酒的生產(chǎn)，由于產(chǎn)量低、耗糧大、優(yōu)質(zhì)品率低、勞動強度大，在很大程度上憑經(jīng)驗指導。近年來，我國釀酒工作者對白酒的釀造在總結(jié)生產(chǎn)規(guī)律的基礎上，從各個方面開展了研究，其中利用生物酯化酶技術(shù)來提高己酸乙酯就是其中主要的方法之一。研究表明[4-8]，在白酒生產(chǎn)中應用的酯化酶制劑具有生香功能，可縮短發(fā)酵周期、提高出酒率和優(yōu)品率。

本項目來源于青酒集團公司的生產(chǎn)實際，針對公司有些車間酒質(zhì)發(fā)生了大的變化，尤其是原酒中的己酸乙酯含量下降，己、乳比不平衡的問題，開展提高青酒大曲酒中的主體香味物質(zhì)的研究。通過前期篩選到一株高產(chǎn)酯化酶的紫色紅曲霉（Monascus purpureus）FBKL3.0018，對其相關(guān)特性進行研究[9-14]，以期利用該菌株生產(chǎn)高酯化大曲來加速窖內(nèi)酒醅的酯化，提高原酒中己酸乙酯含量，調(diào)整己乳比，提高青酒大曲原酒質(zhì)量和優(yōu)質(zhì)品率，同時降低企業(yè)的生產(chǎn)成本，增加經(jīng)濟效益，增強企業(yè)在市場上的競爭力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

紫色紅曲霉（Monascus purpureus）FBKL3.0018：本實驗室前期篩選；小麥、大麥、豌豆：市售。

1.1.2 實驗試劑

葡萄糖：天津市科密歐化學試劑有限公司；氫氧化鈉：成都金山化學試劑有限公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉：天津市致遠化學試劑有限公司；碘、碘化鉀：重慶北碚精細化工廠；次甲基藍、酚酞：天津市大茂化學試劑廠；乙醇：成都科龍化工試劑廠；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

MJX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；JJ-CJ-IFD超凈工作臺：蘇州市金凈化設備科技有限公司；酯化酶培養(yǎng)房及配套裝置：青酒集團有限公司自制；LS-SOHJ立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；MC酒精計：河北省武強縣億達儀表廠；安捷倫6890N氣相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大曲制曲工藝流程

（1）酯化大曲制曲工藝流程

（2）普通大曲制曲工藝流程除不添加菌懸液外，其余工藝同酯化大曲制曲工藝流程

（3）制曲工藝：原料質(zhì)量比為小麥∶大麥∶豌豆=6∶3∶1，接種量為10 g/kg，曲醅加水量控制為40%。采用中溫制曲工藝，最高溫度控制在55℃較為適宜，培養(yǎng)時間為25～28 d，貯存使用期為2～3個月最佳。

1.3.2 高酯化大曲應用于青酒的生產(chǎn)

（1）不減曲時酯化大曲添加量實驗

將酯化大曲與普通大曲混合加入酒醅，用曲總量為投料量的25%，其中酯化大曲與普通大曲之比分別為實驗組1（5∶20），實驗組2（8∶17），實驗組3（10∶15），實驗組4（15∶10），對照組（0∶25）。每個實驗做10個窖池，發(fā)酵周期為45 d，工藝條件及操作同普通濃香型大曲。

（2）減曲時添加酯化大曲的實驗

將酯化大曲與普通大曲混合加入酒醅，用曲總量及酯化大曲與普通大曲比例分別表示如下：實驗組A（用曲量24%，8∶16）；實驗組B（用曲量22%，8∶14）；實驗組C（用曲量20%，8∶12）；實驗組D（用曲量18%，8∶10）；對照組（用曲量25%，0∶25）。每個實驗做10個窖池，發(fā)酵周期為45 d，工藝條件及操作同普通濃香型大曲。

1.3.3 測定方法

（1）入窖前后酒醅的水分、酸度及淀粉含量：參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[15]。

（2）酒樣中總酸、總酯、酒精度、出酒率、優(yōu)質(zhì)品率及微量成分：參照GB/T10345—2007《白酒分析方法》[16]。

（3）氣相色譜條件：色譜柱為Zebron ZB-5MSI彈性石英毛細管柱（30 cm×0.25 mm×0.25 μm），柱溫升溫程序：初始溫度35℃，保持1min，以2℃/min升溫至120℃，再以8℃/min升溫至200℃；進樣口溫度230℃，檢測器溫度250℃；進樣量500 μL；載氣流速0.8 mL/min；尾吹氣：20 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯化大曲和普通大曲理化指標比較

表1 酯化大曲和普通大曲理化指標比較Table 1 Comparison of physicochemical indicators between esterified Daqu and ordinary Daqu

從表1可看出，與普通大曲相比，酯化大曲的水分含量、發(fā)酵力、酯化力、液化力較高，其中酯化力約為普通大曲的1.75倍；酸度、糖化力較低，糖化力約為普通大曲的48%。

2.2 酯化大曲添加量實驗

2.2.1 入窖前后酒醅的水分、酸度及淀粉含量比較

在入窖前和出窖后對各實驗組酒醅的水分、酸度及淀粉含量進行測定，結(jié)果如表2所示。

表2 酯化大曲添加量對入窖前后酒醅水分、酸度及淀粉含量的影響Table 2 Effect of esterified Daqu addition on the water content,acidity and starch content of fermented grains before and after pit entry

從表2可看出，實驗與對照組的水分、酸度及淀粉含量在入窖前相差不大，入池條件基本相同。出窖后酒醅水分和淀粉含量均有上升且數(shù)據(jù)變化幅度相近，但酒醅酸度有所降低，推測是酯化酶將其中部份酸轉(zhuǎn)化為相應的酯類香味物質(zhì)。

2.2.2 酯化大曲添加量對釀酒生產(chǎn)實驗結(jié)果的影響

發(fā)酵結(jié)束后，對不同酯化大曲添加量的實驗進行取樣蒸酒，再測定和計算各自酒樣中的酒精度、總酸、總酯、出酒率及優(yōu)質(zhì)品率，結(jié)果如表3所示。

表3 酯化大曲添加量對釀酒生產(chǎn)的影響Table 3 Effect of esterified Daqu addition on liquor production

由表3可看出，添加酯化大曲時，4個實驗組酒樣的總酸、總酯、出酒率、優(yōu)質(zhì)品率均高于對照組酒樣；當實驗組2即酯化大曲與普通大曲用量比例為8∶17時，出酒率比對照組提高了1.7%，優(yōu)質(zhì)品率提高了10.6%，其出酒率、優(yōu)質(zhì)品率提高幅度最大。

回到十年后血海肉林的靈寶谷，如果屆時我們毫不猶豫地出手殺了哥舒翰，去掉將要輕出潼關(guān)的主帥，大軍就會由混亂里鎮(zhèn)定如常，反攻叛軍，穩(wěn)住陣腳，回師潼關(guān)，天下的大勢就會發(fā)生轉(zhuǎn)換，大唐的元氣會重新凝聚起來。

2.2.3 酯化大曲添加量對酒樣微量成分的影響

對各組酒樣微量成分進行氣相色譜測定，分析各組酒樣中成分種類及含量，實驗結(jié)果如表4所示。

續(xù)表

從表4可看出，添加了酯化大曲的酒樣中主要酯類物質(zhì)如乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯等的含量均高于對照組。在不同添加量實驗組對比中，發(fā)現(xiàn)2號實驗組即酯化曲與普通大曲用量比例為8∶17時己酸乙酯的含量最高，為5.04 g/L。表明通過添加酯化大曲對改善青酒的品質(zhì)有重要作用。

2.3 減曲釀酒時酯化大曲添加量實驗

2.3.1 酯化大曲添加量對減曲釀酒生產(chǎn)實驗結(jié)果的影響

發(fā)酵結(jié)束后，對不同添加量的實驗進行取樣蒸酒，再測定和計算各自酒樣中的總酯、總酸、出酒率、優(yōu)質(zhì)品率結(jié)果如表5所示。

表5 酯化大曲添加量對減曲釀酒生產(chǎn)的影響Table 5 Effect of esterified Daqu addition on liquor production with reducing Daqu addition

從表5可以看出，在酯化曲用量不變的情況下，減少普通曲的用量，4個實驗組酒樣的總酸、總酯均高于對照組；當實驗組B即酯化大曲與普通大曲的比例為8∶14時，出酒率最高，為41.6%，提高了0.7%；優(yōu)質(zhì)品率最高，為64.0%，提高了10.8%。

2.3.2 酯化大曲添加量對減曲釀酒酒樣微量成分的影響

對各組酒樣微量成分進行氣相色譜測定，分析各組酒樣中成分種類及含量，實驗結(jié)果如表6所示。

表6 酯化大曲添加量對減曲釀酒酒樣微量成分的影響Table 6 Effect of esterified Daqu addition on microconstituents in reducing Daqu addition liquor samples g/L

續(xù)表

從表6可看出，添加了酯化大曲的各實驗組酒樣中己酸乙酯的相對含量均高于對照組，且各實驗組酒樣中乳酸乙酯的含量明顯低于對照組，表明通過添加酯化大曲對改善青酒的品質(zhì)有重要作用。

3 結(jié)論

本研究通過從青酒生產(chǎn)過程中分離篩選到的一株高產(chǎn)酯化酶的菌株紫色紅曲霉（Monascuspurpureus，F(xiàn)BKL3.0018）來生產(chǎn)高酯化大曲來加速窖內(nèi)酒醅的酯化，通過酯化大曲添加量實驗，結(jié)果表明，酯化大曲與普通大曲用量為8∶17時，實驗酒樣的總酸、總酯均高于對照酒樣，出酒率、優(yōu)質(zhì)品率比對照組有明顯上升，分別提高1.7%和10.6%，己酸乙酯的含量最高，為5.04 g/L。減曲時添加酯化大曲實驗結(jié)果表明，酯化大曲與普通大曲用量為8∶14時，減曲實驗酒樣的總酸、總酯均高于對照組酒樣，出酒率提高了0.7%，優(yōu)質(zhì)品率提高了10.8%，己酸乙酯含量高于對照組，且乳酸乙酯含量低于對照組。本研究提高原酒中己酸乙酯含量，調(diào)整己乳比，提高青酒大曲原酒質(zhì)量，從而提高青酒的優(yōu)質(zhì)品率，同時也降低企業(yè)的生產(chǎn)成本，增加經(jīng)濟效益，增強企業(yè)在市場上的競爭力，提升貴州省白酒生產(chǎn)企業(yè)的科技水平和創(chuàng)新能力，培養(yǎng)和鍛煉企業(yè)技術(shù)人才和技術(shù)團隊。