王 丹，任 玫，吳 飛，常建軍，李璐瑤，康 明，林 青*

(1.西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.青海大學農牧學院，青海西寧 810016；3.青海大學省部共建三江源生態(tài)與高原農牧業(yè)國家重點實驗室，青海西寧 810016；4.浙江大學動物科學學院/浙江省動物預防醫(yī)學重點實驗室，浙江杭州 310058)

隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種重要的機會性人獸共患腸道原蟲，宿主范圍廣泛，可引起宿主腹瀉和呼吸道癥狀，對兒童和免疫缺陷的宿主造成嚴重腹瀉甚至死亡。目前已報道的隱孢子蟲有效種有33種[1-2]。在我國，人、牛、豬、羊、禽類等均被報道有不同程度的隱孢子蟲感染[3-7]。隱孢子蟲的檢測方法有多種，傳統(tǒng)的病原學檢測方法和免疫學檢測方法對于樣品和檢測人員技術要求較高[8-9]。而目前常用的分子生物學診斷法中的PCR檢測方法過程繁瑣復雜，對儀器設備要求較高，不利于在艱苦偏遠地區(qū)推廣。環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法的建立，提供了一種操作簡單、擴增效率高、特異性強、靈敏度高的檢測技術[10]，被廣泛應用于目標DNA和RNA的檢測[11]。

有文獻報道顯示，青海省牦牛隱孢子蟲的感染率為10.4%～39.7%[12-14]，隱孢子蟲感染對當?shù)仃笈５酿B(yǎng)殖產生非常不利的影響，且可能會帶來人獸共患病傳播的風險。為了更好地防控牦牛隱孢子蟲病的發(fā)生和傳播，早期快速而準確地診斷就顯得非常重要?；诖?，擬建立一種快速而靈敏的牦牛隱孢子蟲檢測方法并將其推廣應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 糞便樣品 試驗用的糞便樣品均由西北農林科技大學獸醫(yī)寄生蟲學實驗室提供，樣品采自青海省放牧飼養(yǎng)的牦牛，在25 g/L重鉻酸鉀溶液中4℃下保存。

1.1.2 蟲種 隱孢子蟲(Cryptosporidium)、藍氏賈第蟲(Giardialamblia)、阿米巴原蟲(Entamoeba)、芽囊原蟲(Blastocystis)4種寄生蟲樣品,均由西北農林科技大學獸醫(yī)寄生蟲學實驗室保存。

1.1.3 主要試劑和儀器 Bst 大片段DNA 聚合酶(Bst DNA Polymerase Large Fragmnet)、10×Themopol Reaction Buffer,New England Biolab公司產品；10000×SYBR GreenⅠ,Solarbio公司產品；MgCl2、dNTP Mixture,TaKaRa公司產品；糞便DNA提取試劑盒,OMEGA公司產品；高速離心機,購自安徽中科中佳科學儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋,購自國華電器有限公司；PCR擴增儀,購自杭州博日科技有限公司；DYY-7C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀,購自北京六一廠。

1.2 方法

1.2.1 糞便基因組DNA提取 每份樣品取0.5 mL 于1.5 mL EP管中，加入蒸餾水洗滌5次，以洗去重鉻酸鉀溶液。然后根據(jù)EZNA?Stool DNA Kit 提供的步驟提取樣品基因組DNA。獲得的DNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設計和合成 本試驗對牦牛源的C.parvum、C.bovis、C.ryanae(GenBank登錄號分別為KY809008、KF128742、KY809007)的18 S rRNA基因序列進行比對，設計6條LAMP引物，引物由北京藍譜生物科技有限公司設計，引物序列見表1。套式PCR擴增引物參照Xiao L等[15]設計的基于隱孢子蟲18 S rRNA基因的2對引物，其序列見表2。引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 隱孢子蟲18 S rRNA 基因的LAMP引物

表2 隱孢子蟲18 S rRNA基因的套式PCR引物

1.2.3 LAMP方法的優(yōu)化及建立 參考NEW ENGLAND BioLabs擴增反應體系，對反應體系進行優(yōu)化，通過調整外引物、內引物和環(huán)引物的比例，確定反應最佳引物濃度。調整buffer、MgCl2、dNTP Mixture及酶的濃度，并對反應過程、時間、溫度進行優(yōu)化，反復試驗確定最佳反應體系和反應條件。

1.2.4 特異性試驗 分別選用隱孢子蟲、藍氏賈第蟲、阿米巴原蟲、芽囊原蟲等原蟲的基因組DNA作為模板，利用建立的LAMP方法進行擴增反應，并用雙蒸水作為空白對照。產物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察，若電泳圖呈現(xiàn)特征性梯狀條帶則判定該反應為陽性。每管產物加1 μL 1 000×SYBR Green Ⅰ，呈現(xiàn)綠色判定為陽性，保持棕色不變判定為陰性。

1.2.5 敏感性試驗 將隱孢子蟲陽性樣本總DNA倍比稀釋，測定樣本DNA的濃度為26 ng/μL。以稀釋樣本作為模板，分別用建立的LAMP方法和套式PCR方法進行檢測，比較兩種方法的敏感性。

1.2.6 重復性試驗 以相同的隱孢子蟲陽性DNA為模板，用建立的LAMP方法進行6次重復試驗，以驗證批內重復性。同時對6份隱孢子蟲陽性樣本進行批間重復試驗，重復3次，以驗證批間重復性。

1.2.7 樣品檢測 用所建立的LAMP方法對在青海省某地區(qū)采集的60份牦牛糞便樣品進行檢測，同時用套式PCR方法進行檢測對比。

2 結果

2.1 LAMP反應體系的確定

通過優(yōu)化反應條件，隱孢子蟲LAMP反應體系為25 μL：F3、B3引物(10 mmol/L)各0.25 μL，F(xiàn)IP、FBP引物(10 mmol/L)各2 μL，LP、LB引物(10 mmol/L)各1 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)3.5 μL,Bst DNA 聚合酶(8 U/μL)1 μL，10× Themopol reaction buffer 1.5 μL，DNA模板2 μL，超純水補足25 μL。反應體系終濃度見表3。擴增條件：反應混合物先在95℃水浴加熱5 min，置于冰上冷卻5 min，加Bst 大片段DNA 聚合酶，然后65℃孵育60 min，最后80℃加熱10 min終止反應(表3)。

2.2 特異性試驗結果

利用建立的LAMP方法對隱孢子蟲、藍氏賈第蟲、阿米巴原蟲、芽囊原蟲等陽性樣品進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)只有隱孢子蟲陽性樣品中能擴增出LAMP產物特有的梯狀條帶(圖1)，產物加入1 μL 1 000×SYBR Green Ⅰ后，也只有隱孢子蟲LAMP產物呈現(xiàn)綠色(圖2)。

表3 LAMP反應體系

M.DNA標準DL 2 000；1.隱孢子蟲；2.藍氏賈第蟲；3.阿米巴原蟲；4.芽囊原蟲；5.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000；1.Cryptosporidium；2.G.lamblia；3.E.histolytica；4.Blastocystis； 5.Negative control

圖1 LAMP方法的特異性試驗結果

Fig.1 The specificity test result of LAMP

1.隱孢子蟲；2.藍氏賈第蟲；3.阿米巴原蟲；4.芽囊原蟲；5.陰性對照

1.Cryptosporidium；2.G.lamblia；3.E.histolytica；4.Blastocystis； 5.Negative control

圖2 LAMP方法的特異性試驗結果

Fig.2 The specificity test result of LAMP

2.3 敏感性試驗結果

LAMP方法和套式PCR方法檢測結果分別如圖3和圖4所示，LAMP方法能夠檢測出16倍稀釋的樣本DNA，而PCR方法只能檢測2倍稀釋的樣本DNA，試驗表明LAMP的靈敏度是套式PCR方法的8倍。

M.DNA標準DL 2 000；1.陽性對照；2～8.倍比稀釋的DNA

M.DNA Marker DL 2 000；1.Positive control；2-8.Doubling dilution DNA

圖3隱孢子蟲的LAMP檢測結果

Fig.3 The results of LAMP forCryptosporidium

M.DNA標準DL 2 000；1.陽性對照；2～8.倍比稀釋的DNA

M.DNA Marker DL 2 000；1.Positive control；2-8.Doubling dilution DNA

圖4隱孢子蟲的套式PCR檢測結果

Fig.4 The results of nested PCR forCryptosporidium

2.4 重復性試驗結果

對建立的LAMP方法進行批內和批間重復性試驗，檢測結果均為陽性，如圖5和圖6所示。

1～6.LAMP擴增產物；7.陰性對照

1-6.Products of LAMP；7.Negative control

圖5批內重復性試驗結果

Fig.5 The repeatability result of inter-assay

1～6,8～13,15～20.LAMP擴增產物；7,14,21.陰性對照

1-6,8-13,15-20.Products of LAMP；7,14,21.Negative control

圖6批間重復性試驗結果

Fig.6 The repeatability result of intra-assay

2.5 樣品檢測

對60份采自青海的牦牛糞便樣品分別用LAMP方法和套式PCR方法進行檢測，兩種方法均檢測出一一對應的11份陽性樣品，符合率為100%。

3 討論

目前，隱孢子蟲的檢測方法包括傳統(tǒng)的病原學、免疫學和分子生物學方法。傳統(tǒng)的病原學檢測法主要利用改良抗酸染色法、熒光染色法等進行卵囊檢測，費時費力，不適合大量樣本的檢測。常用的免疫學方法有免疫熒光法、隱孢子蟲抗體間接ELISA法，特異性和靈敏度較分子生物學方法稍差[16]。常用的分子生物學診斷方法有普通PCR、套式PCR、實時熒光定量PCR和LAMP檢測方法，這些方法檢測靈敏，結果可靠，并適合用于大量樣本檢測。其中LAMP方法比PCR方法更加簡便、靈敏，不需要昂貴的儀器設備和復雜溫度變化過程，整個反應只需1.5 h，反應結果可以電泳檢測，也可通過染料顯色直接判定，更加適合在實驗條件較差的偏遠地區(qū)推廣使用。

本試驗根據(jù)LAMP的原理，針對隱孢子蟲18 S rRNA基因，設計6條引物，優(yōu)化并建立LAMP方法。選用陽性隱孢子蟲、藍氏賈第蟲、阿米巴原蟲和芽囊原蟲作為對照，同時以雙蒸水作為陰性對照，檢驗該組引物的特異性。試驗結果顯示，LAMP擴增產物電泳只有陽性隱孢子蟲出現(xiàn)梯狀條帶，且染料顯色呈陽性，其他幾個原蟲和陰性對照組均無條帶出現(xiàn)，且染料顯色均呈陰性。表明該組引物特異性良好。敏感性試驗顯示LAMP方法比套式PCR方法靈敏度高8倍。批內和批間重復性試驗結果均為陽性，表明該方法重復性良好。同時對LAMP方法和套式PCR方法的檢出率進行比較，從數(shù)據(jù)來看，所建立的LAMP方法檢測陽性率結果和套式PCR檢測結果是一致的。本試驗所建立的LAMP方法具有較好的特異性、靈敏性和重復性，可以作為一種快速、簡單且靈敏的檢測方法對牦牛源隱孢子蟲進行檢測。

LAMP方法也存在著一定的缺陷，比如其產物復雜，不能測序鑒定，也不能進行分型，只適用病原檢測。而且LAMP反應敏感性高，因此較易出現(xiàn)氣溶膠污染[17]，可以加入可見光染料代替熒光染料進行檢測，對于避免開蓋污染引起的假陽性有一定的效果[18]。繼續(xù)探索和完善該技術，以便在臨床廣泛應用，對于及時監(jiān)控和預防疫病的傳播具有重要作用。

本試驗建立的LAMP方法為牦牛隱孢子蟲感染的檢測提供了有效的方法，對于青海等偏遠地區(qū)牦牛隱孢子蟲病的防控具有重要意義。