李新培，朱洪偉，周偉光，關平原，程世鵬，溫永俊*

(1.中國農業(yè)科學院特產研究所特種經濟動物分子生物學國家重點實驗室，吉林長春 130112；2.內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院/農業(yè)部動物疾病臨床診療技術重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010018)

牛病毒性腹瀉/黏膜病(Bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染引起的一種接觸性傳染病，可造成感染牛嚴重的消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)疾病及免疫抑制等。1946年，Olafson在美國紐約首次報道BVD-MD的發(fā)生，稱該病典型的臨床癥狀是腹瀉。1953年，美國衣阿華州的首例MD被發(fā)現和報道，該病以胃腸道黏膜潰瘍?yōu)樘卣鱗1]。由于是由同一種病毒所引起，因此，美國獸醫(yī)協會將BVDV感染引起的疾病統(tǒng)一命名為“牛病毒性腹瀉/黏膜病”(BVD-MD)。李佑民在我國首次從流產胎兒的脾臟中成功分離并鑒定出BVDV。該病在世界范圍內分布廣泛，給養(yǎng)牛業(yè)造成較大的經濟損失，被我國列為三類疫病。目前，國外主要通過接種疫苗、淘汰抗體陰性的持續(xù)性感染牛的措施來控制該病。盡管BVD-MD是影響世界養(yǎng)牛業(yè)一種重要的傳染病，然而由于該病尚未在我國引起大規(guī)模的暴發(fā)和流行，也不存在公共衛(wèi)生問題，該病往往很少引起人們的重視。然而，隨著養(yǎng)牛業(yè)規(guī)模化的發(fā)展，該病造成巨大損失，逐漸被人們熟知。因此，控制和徹底消除該病顯得尤為重要。建立一種快速、高效的抗原檢測方法，為BVD-MD的診斷和流行病學研究提供物質基礎，對BVDV的防控意義重大。

BVDV是一種單股正鏈RNA病毒，成熟的BVDV病毒顆粒呈球狀，直徑大約46 nm。在非致病毒株上大約有12 300個堿基。BVDV在分類上屬于黃病毒科瘟病毒屬。根據同源基因和結構特征進行劃分，黃病毒科成員還包括西尼羅河病毒、登革熱病毒、黃熱病病毒和丙型肝炎病毒。BVDV整個基因組由3′UTR、ORF編碼區(qū)和5′UTR共同組成一個大的開放閱讀框架，能編碼所有的病毒蛋白[2]。

BVDV最初被認為只有一種類型，但是病毒的基因組RNA序列分析及復雜的抗原特征表明BVDV有2種不同的類型。根據能否引起細胞病變，可將BVDV分為2種生物型：一種為致細胞病變型(cytopathogenic，CP)，病毒在細胞中復制能夠引起細胞形成空泡、核固縮、溶解和死亡等病變；另一種為非致細胞病變型(noncytopathogenic，NCP)，病毒在細胞中復制不引起細胞病變[3]。依據保守的5′UTR基因序列將BVDV分為2種基因型，即BVDV1和BVDV2。近年來，巴西、歐洲等發(fā)現BVDV3型，但我國沒有BVDV3型相關報道。5′UTR折疊可形成細胞轉譯蛋白識別的結構，該蛋白能指示核糖體結合并在AUG密碼子處啟動蛋白質的翻譯。因此，5′UTR區(qū)域可以調控病毒的復制、轉錄和翻譯過程。根據已發(fā)表的 BVDV1 型和 BVDV2 型毒株5′UTR區(qū)域序列的分析和比較，可知5′UTR基因序列在BVDV1 和BVDV2間具有較高的保守程度，但同時也包含1型與2型 BVDV的差異性位點，因此，常用該區(qū)域對BVDV進行鑒定及分型。近幾年來BVDV 在我國的流行狀態(tài)呈明顯的上升趨勢，但關于 BVDV 具體感染情況及可靠的檢測方法的研究報道甚少，本研究旨在建立一種能鑒定并可以在同一體系中對BVDV進行分型的RT-PCR檢測方法，從而對BVDV感染進行早期快速準確診斷，篩選抗體陰性的持續(xù)性感染牛，為進一步開展流行病學調查、發(fā)現新毒株及持續(xù)性感染動物的清群和凈化等提供技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和細胞系 牛病毒性腹瀉病毒Ht01陽性毒株(BVDV-1型)、牛病毒性腹瀉病毒296陽性毒株(BVDV-2型)、豬瘟病毒(CSFV)、牛副流感病毒(BPIV-3)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBR)、牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)及MDBK細胞，均為內蒙古農業(yè)大學傳染病教研室保存。

1.1.2 主要儀器及試劑 超低溫高速離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，Trizol Invitrogen公司產品；M-MLV反轉錄酶，Promega公司產品；PCR相關ExTaq酶、dNTP等，寶生物工程(大連)有限公司產品；DMEM和胎牛血清，Gibco公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據GenBank中已公布的BVDV序列，選擇BVDV1a-Oregon C24V、BVDV1a-NADL、BVDV1a-Singer、BVDV1b-NY1、BVDV1b-TGAG、BVDV2-1373、BVDV2-296等18株基因序列，運用MEGA 7進行序列比對，選擇保守區(qū)域5′UTR附近分別設計鑒定及分型引物，引物由吉林庫美生物公司合成。引物序列及大小見表1。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和病毒增殖 用含80 g/L的胎牛血清培養(yǎng)MDBK細胞，待細胞長成單層后，接種實驗室分離鑒定并保存的Ht01陽性毒株(BVDV-1型)、牛病毒性腹瀉病毒296陽性毒株(BVDV-2型)，逐日觀察CPE,當75%的MDBK細胞有明顯CPE時，反復凍融3次，收獲病毒。

1.2.3 病毒RNA提取 取500 μL病毒液，加入500 μL Trizol，按照Trizol手提RNA的操作說明提取病毒的基因組RNA，用12 μL DEPC 水溶解RNA，置-80℃凍存或立即進行反轉錄。

表1 引物序列及擴增片段大小

注：S1/S2為鑒定引物；F1/F2為BVDV1型引物；P1/P2為BVDV 2型引物。

Note：S1/S2 are the detection primers; F1/F2 are the BVDV type 1 primers; P1/P2 are the BVDV type 2 primers.

1.2.4 RT-PCR擴增條件優(yōu)化 反轉錄體系如下：RNA模板11 μL，隨機引物(μmol/L)1 μL、Promega M-MLV 0.5 μL、5×Promega M-MLV buffer 5 μL、10 mmol/L dNTPs 5 μL、RRI 0.5 μL,獲得cDNA模板。

PCR體系如下：cDNA模板1.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ExTaq酶0.5 μL,10× PCR ExTaqbuffer 2.5 μL,dNTPs 2 μL,加滅菌去離子水至25 μL。

PCR程序設置為:94℃預變性7 min;94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸35 s,35個循環(huán);72℃延伸10 min。

1.2.5 特異性試驗 按照1.2.3和1.2.4的方法分別提取Ht01陽性毒株、296陽性毒株、豬瘟病毒、牛副流感病毒、牛呼吸道合胞體病毒及MDBK細胞的RNA，并進行反轉錄，用DNA提取試劑盒提取牛傳染性鼻氣管炎病毒DNA，進行RT-PCR擴增，分別檢測PCR產物，以驗證本方法的特異性。由于豬瘟病毒與BVDV同屬于黃病毒科瘟病毒屬，故選擇豬瘟病毒進行特異性試驗，其他病毒為臨床常見的牛易感病毒，與BVDV進行鑒別診斷。

1.2.6 敏感性試驗 取本實驗室保存的HT01陽性毒株(BVDV1型)、296陽性毒株(BVDV2型)在MDBK細胞上增殖，分別測定TCID50/mL，10倍倍比稀釋BVDV病毒。按照1.2.3和1.2.4的方法在相同條件下提取稀釋病毒的RNA并進行RT-PCR擴增，驗證本方法的敏感性[4]。

1.2.7 重復性試驗 將本研究建立的鑒定及分型RT-PCR檢測方法按照優(yōu)化好的體系進行3次以上的重復性試驗，驗證其穩(wěn)定性，以確保本方法穩(wěn)定可靠。

1.2.8 臨床樣品檢測 收集臨床樣品48份，抽提核酸后，運用所建立的鑒定及分型RT-PCR檢測方法分別檢測，并進行測序分析，驗證本方法的可靠性。

2 結果

2.1 BVDV目的基因RT-PCR擴增

鑒定引物、分型引物在不同體系及同一體系檢測Ht01和296毒株，取5 μL PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，可見在目的條帶附近有特異性條帶，大小分別為288 bp(鑒定引物)、316 bp(1型引物)、110 bp(2型引物)，與預期大小一致，陰性對照擴增不出任何條帶，電泳結果見圖1。

M.DNA標準DL 2 000；1. BVDV Ht01及296鑒定引物RT-PCR擴增；3. Ht01 1型引物RT-PCR擴增；5. 296 2型引物RT-PCR擴增；7. Ht01.296同一體系分型引物RT-PCR擴增；2,4,6,8.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000；1.Products of RT-PCR of BVDV Ht01 and 296 using detection primers;3.Products of RT-PCR of BVDV Ht01 using type1 primers；5.Products of RT-PCR 296 using type 2 primers；7.Products of RT-PCR of BVDV Ht01 and 296 using type 2 and type 1 primers；2,4,6,8.Negative control

圖1 BVDV鑒定和分型RT-PCR結果

Fig.1 RT-PCR results of BVDV using detection
and distinguishing type primers

2.2 PCR反應條件優(yōu)化

以不同的退火溫度進行梯度PCR反應，反應結束后，按照常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳方法，取6 μL RT-PCR產物進行檢測，確定最佳退火溫度。鑒定引物退火溫度確定為56℃(圖2)，分型引物退火溫度確定為57℃(圖3)，檢測。

BVDV鑒定RT-PCR方法優(yōu)化后的程序設置為:94℃預變性7 min;94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,35個循環(huán);72℃延伸10 min。

BVDV分型RT-PCR方法優(yōu)化后的程序設置為:94℃預變性7 min;94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸35 s,35個循環(huán);72℃延伸10 min。

2.3 特異性試驗

建立的鑒定及分型RT-PCR檢測方法能特異性的在Ht01陽性毒株、296陽性毒株中擴增出目的片段，而在豬瘟病毒、牛副流感3型病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛呼吸道合胞體病毒及MDBK細胞中不能擴增出目的片段，證明該方法具有良好的特異性(圖4和圖5)。

M.DNA標準DL 2 000；1～9.退火溫度分別為53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃

M.DNA Marker DL 2 000；1-9.Annealing temperatures 53℃,54℃,55℃,56℃,57℃,58℃,59℃,60℃,61℃,respectively

圖2鑒定引物退火溫度優(yōu)化測定結果

Fig.2 Optimization results of detection primer annealing temperature

M.DNA標準DL 2 000；1～8.退火溫度分別為53℃、54℃、55℃、56℃、 57℃、58℃、59℃、60℃

M.DNA Marker DL 2 000；1-8.Annealing temperatures 53℃,54℃,55℃,56℃,57℃,58℃,59℃,60℃,respectively

圖3分型引物退火溫度優(yōu)化測定結果

Fig.3 Optimization results of type primer
annealing temperature

M.DNA標準DL 2 000；1.BVDV 296陽性病毒；2.CSFV；3.BPIV-3；4.IBRV；5.BRSV；6.MDBK細胞；7.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000；1.BVDV 296 Positive virus；2.CSFV；3.BPIV-3；4.IBRV；5.BRSV；6.MDBK cells；7.Negative controls

圖4鑒定引物特異性檢測結果

Fig.4 Specificity test results of detection primers

2.4 敏感性試驗

經測定，HT01陽性毒株(BVDV -1型)、296陽性毒株(BVDV-2型)病毒滴度分別為105TCID50/mL和104TCID50/mL，分別10倍倍比稀釋BVDV病毒，按照1.2.3和1.2.4的方法分別提取病毒的RNA，并進行反轉錄，分別檢測PCR產物，測定敏感性。鑒定引物敏感性試驗選擇HT01陽性毒株為模板，分型引物敏感性試驗需要將HT01和296毒株稀釋后以相同TCID50/mL 1∶1混合作為模板。結果表明，鑒定引物最低可檢測出1 TCID50/mL的病毒(圖6)，分型引物最低可檢測出10 TCID50/mL的病毒(圖7)，證明該方法具有較好的敏感性。

M.DNA標準DL 2 000；1.BVDV Ht01及296病毒；2.CSFV；3.BPIV-3；4.IBRV；5.BRSV；6.MDBK細胞；7.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000；1.BVDV Ht01 and 296 Virus；2.CSFV；3.BPIV-3；4.IBRV；5.BRSV；6.MDBK cells；7.Negative controls

圖5分型引物特異性檢測結果

Fig.5 Specificity test results of type primers

M.DNA標準DL 2 000；1～7.HT01陽性病毒滴度分別為104～10-2TCID50/mL；8.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000；1-7.The titers of HT01 positive virus 104-10-2TCID50/mL；8.Negative control

圖6鑒定引物敏感性試驗檢測結果

Fig.6 Sensitivity test results of detection primers

M.DNA標準DL 2 000；1～6.HT01、296陽性病毒滴度分別為104～10-1TCID50/mL；7.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000；1-6.The titers of HT01 and 296 positive virus 104-10-2TCID50/mL；7.Negative control

圖7分型引物敏感性試驗檢測結果

Fig.7 Sensitivity test results of type primers

2.5 重復性試驗

將本研究建立的RT-PCR檢測方法進行3次以上的重復性試驗，試驗結果一致，證明本方法安全可靠。

2.6 臨床樣品檢測

將臨床采集的48份病料(肺組織)，研磨處理并進行RT-PCR擴增，首先用鑒定引物對病料進行檢測，共檢出6份疑似樣品，陽性率為25%(圖8)。按照同樣的方法用建立的分型RT-PCR檢測方法檢測樣品，結果擴出大小為316 bp的片段(圖9)，表明該病料中的病毒為BVDV 1型，將擴增片段分別克隆到PMD-19 T載體送至公司測序，采用MEGA 7 構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果表明，病料組織中存在的是同一種病毒，該病毒與已公布的BVDV Ch10-4R株同源性可達99%，歸屬于BVDV 1型。

利用分子生物學軟件MEGA6對分離株NM的5′UTR序列進行分析，基于最大似然法所建立的進化樹是由 GenBank 上下載的 19 個分離株的5′UTR序列所建立的。根據遺傳進化樹分析，分離株NM與BVDV 1 型毒株Ch10-4R毒株進化關系最為密切，分離株NM 5′UTR 基因進化樹構建結果見圖10。

3 討論

臨床上診斷BVD-MD可根據腹瀉、消瘦、黏膜潰瘍、流產和白細胞減少等癥狀初步篩選，確診需要在實驗室水平進行檢測。目前，國內外報道的BVDV檢測方法分為抗體和抗原檢測。抗體檢測如酶聯免疫吸附試驗、中和試驗、瓊脂擴散試驗等?？乖瓩z測方法有病毒分離、RT-PCR、免疫熒光技術和核酸雜交技術等[5]。抗體檢測結合抗原檢測可以準確診斷。首先，抗體檢測無法篩選早期感染的病畜及產生免疫耐受的持續(xù)性感染牛。胎兒感染情況取決于母畜子宮內感染時間的不同。母畜受孕至胎兒160 d期間為器官發(fā)育時期，胎兒90 d～280 d出生期間為免疫系統(tǒng)發(fā)育時期。妊娠牛0～30 d感染BVDV，胎兒流產、死亡，抗體陰性；妊娠牛30 d～150 d感染BVDV，胎兒為持續(xù)性感染犢牛，由于免疫系統(tǒng)尚未健全，產生免疫耐受，抗體陰性，病毒陽性。持續(xù)性感染犢牛生長遲緩，并向環(huán)境中不斷散播BVDV且難以根除。因此，篩選抗體陰性的持續(xù)性感染?？滩蝗菥廩6]?？乖瓩z測可以避免漏檢持續(xù)性感染牛，而且可以避免與BVDV同屬的豬瘟病毒的血清學免疫交叉反應。

Horwood P F等[7]開發(fā)了使用Taqman探針的多重熒光定量PCR方法以同時檢測牛皰疹病毒、牛病毒性腹瀉病毒和牛副流感病毒3種重要的呼吸道病毒，試驗證明該方法與單重熒光定量PCR方法比較，靈敏性相當。但該法成本較高，需要貴重儀器，需要專業(yè)分析等。溫凱[8]建立的分型RT-PCR檢測方法中5′UTR引物不能擴增出特異性良好的BVDV 基因2型毒,并且擴增的2種基因型的產物大小相近，使得該方法不能夠在同一個反應體系中完成檢測，因而根據NS5B基因序列建立了多重套式RT-PCR方法。顧蓓蓓等[9]建立了BVDV普通RT-PCR和套式RT-PCR檢測方法，該方法能快速、低含量地檢測生物制品中BVDV污染的樣品，但該套式RT-PCR方法需要分別在不同體系中進行，損耗試劑耗材，且降低了工作效率。

M.DNA標準DL 2 000；1～48.臨床樣品；+.陽性對照；-.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000；1-48.Clinical samples；+.Positive control；-.Negative control

M.DNA標準DL 2 000；1～6.臨床樣品；7.陽性對照；8.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000；1-6.Clinical samples；7.Positive control；8.Negative control

圖9分型引物檢測臨床樣品結果

Fig.9 Detection results of clinical samples using type primers

目前，BVDV是反芻動物最嚴重的病原體之一，臨床癥狀由不明顯到重度急性出血性綜合癥程度不等，發(fā)病的嚴重程度和動物品種密切相關，在世界范圍內分布廣泛，給養(yǎng)牛業(yè)造成較大的經濟損失。此外，胎牛血清為疫苗生產及科研工作必不可少的材料，進口及國產胎牛血清中BVDV污染率很高，王競晗等[10]從進口胎牛血清中分離出牛病毒性腹瀉病毒并命名為BVDV FBS2014,不僅影響試驗效果，造成生物制品污染，而且將外來BVDV引進我國，造成巨大損失。因此，疫苗生產及購買進口血清時應嚴格把關。本研究建立的方法不僅可以診斷BVD，而且實現了對陽性樣品在同一體系中高效快速地區(qū)分基因型，可以對疫苗生產所用的細胞、血清等進行檢測，避免細胞受到污染，嚴防外來BVDV傳入我國。

圖10 根據BVDV 5′UTR基因繪制的遺傳進化樹

BVDV 5′UTR基因序列具有較高的保守程度，但也包含1型與2型BVDV的差異性位點，因此，常用該區(qū)域對BVDV進行鑒定及分型。本研究根據5′UTR序列分別設計鑒定及分型引物，在普通RT-PCR方法的基礎上，將檢測1型和2型BVDV的分型引物放在一個PCR反應體系中，通過優(yōu)化PCR反應條件，建立了可以在同一體系中進行分型的RT-PCR方法, 應用鑒定RT-PCR方法可從BVDV陽性毒株中擴增出288 bp的目的片段；而分型RT-PCR檢測方法可在同一體系中從BVDV 1型和BVDV 2型中擴增出大小分別為316 bp和110 bp的特異性片段。本試驗中建立的檢測及分型方法具有良好的特異性、敏感性和重復性。鑒定引物最低可檢測出1 TCID50/mL的病毒，分型引物最低可檢測出10 TCID50/mL的病毒，分型引物敏感性略低，原因可能與雙重PCR引物設計、優(yōu)化條件等因素有關，導致靈敏性較低，下一步可嘗試優(yōu)化條件、熒光定量PCR的方法進行分型檢測。建立的檢測及分型方法為進一步開展BVDV流行病學調查、病毒分離持續(xù)性感染牛的清群凈化等提供了技術手段。