韓 林 楊人乙 胡 悅 蔣 維

(1. 重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶 404100；2. 渝東北特色生物資源開發(fā)利用工程中心，重慶 404100)

藜麥(Chenopodiumquinoa)又稱昆諾阿藜、南美藜等，是一種原產(chǎn)于南美洲的蓼科類植物，約250個品種，有著5 000 多年的種植歷史[1-2]。藜麥營養(yǎng)豐富，含有大量蛋白質(zhì)、碳水化合物和其它活性成分，其蛋白質(zhì)平均含量高達(dá)15%，高于大米、玉米、大麥等糧食作物，主要由白蛋白(35%)和球蛋白(37%)構(gòu)成；淀粉含量約占藜麥總重的52%～69%，同時膳食纖維含量也高達(dá)7.0%～9.7%[1]。此外，大量研究[3-5]表明，藜麥中多酚含量也非常豐富，主要由槲皮素、蘆丁、山奈酚、阿魏酸、原兒茶酚及香草酸等活性成分組成。研究[1,6]發(fā)現(xiàn)，藜麥具有抗氧化、抗炎、降血糖和減肥等多種生理功效，而這些功能活性與藜麥中豐富的營養(yǎng)成分，特別是多酚、黃酮及皂苷類物質(zhì)密不可分。因此，提高藜麥中功能活性成分的含量便可大大增加其營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價值。郭謀子等[2]研究表明，浸泡及催芽處理可提高藜麥中膳食纖維和黃酮類化合物的含量，使其營養(yǎng)更加均衡合理。然而國內(nèi)外關(guān)于發(fā)酵處理對藜麥中活性成分如多酚的影響則鮮有報道。

本試驗選用酵母菌對藜麥進(jìn)行發(fā)酵處理，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化其發(fā)酵工藝，考察各因素對藜麥發(fā)酵過程中多酚積累的影響。同時，應(yīng)用HPLC對發(fā)酵前后藜麥中的主要酚類物質(zhì)進(jìn)行分析，比較發(fā)酵前后對藜麥抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響，旨在探索提升藜麥營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價值的新方法，為藜麥的深入開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

酵母菌：安琪酵母股份有限公司；

藜麥：山西稼祺農(nóng)業(yè)科技有限公司；

槲皮素、蘆丁、山奈酚、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度為98%，上海源葉生物科技有限公司；

DPPH、ABTS：美國Sigma公司；

α-葡萄糖苷酶、pNPG：美國Sigma公司；

無水甲醇、過硫酸鉀等其它試劑：國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：LC20A型，日本島津公司；

電子分析天平：AL104型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

紫外-可見分光光度計：UEC0905005型，上海博普達(dá)儀器制造有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE52-86A型，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 總酚含量的測定 準(zhǔn)確量取50 mL體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，加入10 g藜麥發(fā)酵樣品中，60 ℃條件下水浴提取30 min，離心后過濾，殘渣再次提取2次，合并濾液，低壓旋轉(zhuǎn)濃縮至25 mL后進(jìn)行總酚含量的測定。采用Folin-酚法測定藜麥發(fā)酵樣品提取液中總酚含量[7]，具體操作為：準(zhǔn)確移取1.0 mL提取液，加入1.0 mL Folin-酚顯色劑，混勻后靜置3 min，再加入1.0 mL濃度為1.0 mol/L的Na2CO3水溶液，用蒸餾水定容至10.0 mL，混合均勻，室溫下避光放置1 h后于725 nm處測定吸光度，同時以蘆丁作標(biāo)準(zhǔn)品得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為Y=2.817 5X-0.001 5，R2=0.993。藜麥發(fā)酵樣品中總酚含量按式(1)計算：

(1)

式中：

c——發(fā)酵藜麥中總酚含量，mg/g；

m1——提取液中總酚含量，mg；

m2——藜麥發(fā)酵樣品質(zhì)量，g。

1.2.2 單因素試驗

(1) 菌種添加量對總酚含量的影響：準(zhǔn)確稱取藜麥粉末10 g，分別按0.25%，0.50%，1.00%，2.00%，4.00%添加酵母菌，再加入20 mL蒸餾水，28 ℃下發(fā)酵48 h后，按1.3.1方法進(jìn)行總酚的提取和測定。

(2) 發(fā)酵時間對總酚含量的影響：準(zhǔn)確稱取藜麥粉末10 g，酵母菌添加量為2.0%，加入20 mL蒸餾水于28 ℃發(fā)酵不同時間(24，48，72，96，120 h)后，按1.3.1方法進(jìn)行總酚的提取和測定。

(3) 水分添加量對總酚含量的影響：分別稱取藜麥粉末10 g，加入不同體積(10，15，20，25，30 mL)的蒸餾水，再加入2.0%的酵母菌，于28 ℃下發(fā)酵48 h后，按1.3.1方法進(jìn)行總酚的提取和測定。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗，優(yōu)化酵母菌添加量、發(fā)酵時間、水分添加量對藜麥發(fā)酵過程中總酚積累的工藝條件。

1.2.4 HPLC分析 色譜條件為： Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，檢測波長280 nm。流動相A和B分別為：乙酸水(pH 2.6)、色譜甲醇，洗脫條件為：0～15 min，15%～25%流動相B；15～25 min，25%流動相B；25～65 min，25%～75%流動相B；65～80 min，75%～15%流動相B；流速為0.8 mL/min。根據(jù)保留時間和峰面積外標(biāo)單點(diǎn)法進(jìn)行定性和定量分析[8]。

1.2.5 抗氧化活性

(1) 對DPPH自由基的清除能力：根據(jù)文獻(xiàn)[9]，修改如下：分別稱取1 g藜麥發(fā)酵樣品(響應(yīng)面優(yōu)化最佳條件下發(fā)酵所得)和未發(fā)酵藜麥樣品，按1.3.1方法提取后，低壓旋轉(zhuǎn)濃縮，真空冷凍干燥。將真空冷凍干燥的提取物分別配制成8，16，24，32，40 mg/mL，準(zhǔn)確吸取0.1 mL不同質(zhì)量濃度的各樣品溶液，加入3.9 mL DPPH溶液(25.61 mg/L)，室溫避光反應(yīng)30 min，利用紫外—可見分光光度計在517 nm處測定吸光度As。同時測定得到0.1 mL不同濃度的樣品加入3.9 mL 70%乙醇后的吸光度Aj，以及空白吸光度Ac。按式(2) 計算DPPH自由基的清除率。

(2)

式中：

R——DPPH自由基清除率，%；

As——加入樣品后的吸光度；

Aj——加入70%乙醇后的吸光度；

Ac——空白的吸光度。

(2) 對ABTS自由基的清除能力：根據(jù)文獻(xiàn)[10]，修改如下：準(zhǔn)確吸取0.1 mL不同質(zhì)量濃度(1.0，2.0，4.0，8.0，16.0 mg/mL)的各樣品溶液，加入3.9 mL ABTS溶液，混合均勻后室溫反應(yīng)6 min，置于734 nm處測定吸光度AE，同時進(jìn)行空白試驗得到吸光度AB。按式(3)計算ABTS自由基的清除率。

(3)

式中：

S——ABTS自由基清除率，%；

AB——加入樣品后的吸光度；

AE——加入70%乙醇后的吸光度。

1.2.6α-葡萄糖苷酶抑制活性 根據(jù)文獻(xiàn)[11]，修改如下：用0.1 mol/L pH 6.8的PBS緩沖液配制不同濃度的α-葡萄糖苷酶(3.0×10-7mol/L)和pNPG溶液(3.0×10-4mol/L)。準(zhǔn)確移取25 μLα-葡萄糖苷酶溶液，分別加入25 μL不同濃度的樣品提取物(0.4，2.0，10.0，51.0，128.0 μg/mL)，37 ℃恒溫孵育15 min，再加入50 μL pNPG溶液(0.3 mmol/L)，37 ℃ 恒溫孵育20 min，加入200 μL 0.5 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，于405 nm處測定吸光值，并按式(4)計算各樣品提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

(4)

式中：

I——抑制率，%；

AK——空白的吸光度；

AY——加入樣品后的吸光度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SAS 9.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析中的Duncan’s多重比較法分析結(jié)果間的顯著差異(P<0.05表示具有顯著性差異)。每組試驗均重復(fù)3次，結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

酵母菌添加量、發(fā)酵時間和水分添加量對發(fā)酵藜麥提取物中總酚含量的影響見圖1～3。隨著酵母菌添加量的增加，藜麥經(jīng)發(fā)酵后其總酚含量也逐步增加，但當(dāng)菌種添加量超過2.0%時，總酚含量開始下降(圖1)，說明低濃度的酵母菌發(fā)酵在一定時間內(nèi)可顯著提高藜麥中多酚含量，而濃度過高則會減少多酚的生成。在藜麥發(fā)酵前3 d，總酚含量幾乎呈線性增加，最高可達(dá)5.79 mg/g，而發(fā)酵3 d后總酚含量則逐步減少(圖2)，與李玉珠等[12]報道一致，可能與酵母菌對多酚的消耗和利用有關(guān)。此外，當(dāng)水分添加量為15 mL 時，藜麥經(jīng)發(fā)酵后總酚含量較高，可達(dá)5.50 mg/g，而過多或過少水分添加量都會影響藜麥發(fā)酵過程中總酚的積累(圖3)。多酚通常以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)形式存在于食物中，發(fā)酵過程中，微生物可分泌產(chǎn)生一些酶，作用于結(jié)合態(tài)多酚使其游離，同時也會利用部分多酚進(jìn)行生長繁殖[8]，因此適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵處理可提高藜麥中總酚的含量，增強(qiáng)其功能活性，后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗分別以酵母菌添加量2.0%，發(fā)酵時間3 d 和水分添加量15 mL作為中心值(見表1)進(jìn)行發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化。

圖1 菌種添加量對總酚含量的影響Figure 1 Effect of the amount of yeast on the content of total phenols

圖2 發(fā)酵時間對總酚含量的影響Figure 2 Effect of fermentation time on the content of total phenols

圖3 水分添加量對總酚含量的影響Figure 3 Effect of the amount of water on the content of total phenols

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

采用三因素三水平響應(yīng)面分析方法，優(yōu)化菌種添加量、發(fā)酵時間和水分添加量對藜麥發(fā)酵過程中總酚含量的影響，結(jié)果見表2。利用SAS軟件對結(jié)果進(jìn)行分析可知，總酚含量對X1、X2和X3的二次多項回歸方程為：

表1 響應(yīng)面因素水平編碼表Table 1 Variables and levels in response surface method

表2藜麥發(fā)酵響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

Table 2 Experimental design and result of central composite test on the fermentation of quinoa

試驗號X1X2X3總酚含量/(mg·g-1)110-11.9082-1005.0493-1014.12641-102.81350005.29761103.718701-13.5238-1-103.59490113.629100004.854110005.283120-113.43413-10-12.245140005.310150-1-12.902161012.77717-1104.463

(5)

由表3可知，根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果擬合的回歸模型達(dá)到極顯著水平(P=0.001 2<0.01)，說明此模型與試驗擬合較好，能較為準(zhǔn)確、真實地反映試驗結(jié)果，其復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.95。顯著性檢測結(jié)果(表4)表明，在試驗水平范圍內(nèi)，3個因素對藜麥發(fā)酵中總酚含量均會產(chǎn)生顯著影響，其中菌種添加量(X1)影響最大(P值最小)，水分添加量(X3)次之，而發(fā)酵時間(X2)影響相對較小(P值最大)。同時，各因素之間的交互作用對總酚含量的影響均不顯著(P>0.05)。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression model

表4 二次多項式回歸方程系數(shù)的顯著性分析Table 4 Regression coefficients of predicted quadratic polynomial model

由SAS分析可知，當(dāng)菌種添加量(X1)、發(fā)酵時間(X2)和水分添加量(X3)分別為1.7%、3.3 d(80 h)、15.8 mL時，總酚含量最大，為5.37 mg/g。選擇菌種添加量1.7%，發(fā)酵時間80 h和水分添加量16 mL發(fā)酵藜麥，進(jìn)行驗證實驗，3次平行結(jié)果得到藜麥在上述條件下經(jīng)發(fā)酵后總酚平均含量為(5.31±0.11) mg/g，與模型預(yù)測值非常接近，相對誤差僅為1.12%。同時，與未經(jīng)發(fā)酵的藜麥總酚含量[(2.17±0.08) mg/g]相比，藜麥經(jīng)優(yōu)化發(fā)酵后，總酚含量可提高2倍之多。綜上，本試驗利用響應(yīng)面法優(yōu)化所得的模型與實際試驗結(jié)果接近，可用于預(yù)測藜麥在發(fā)酵過程中總酚含量的變化情況，同時藜麥經(jīng)發(fā)酵處理后，可大大提高其總酚含量，增加其營養(yǎng)價值，具有一定的應(yīng)用和經(jīng)濟(jì)價值。

2.3 藜麥中主要酚類物質(zhì)的分析

研究[13]表明，藜麥中含有豐富的多酚類物質(zhì)，特別是蘆丁、槲皮素及山奈酚等的含量比蕎麥還高，而這些活性成分的含量直接影響著藜麥的生理功能。發(fā)酵前后藜麥提取物的高效液相色譜分析見圖4。由圖4可知，未發(fā)酵藜麥中蘆丁含量較為豐富[(262.2±5.39) mg/kg]，發(fā)酵處理后其含量稍有下降[(219.5±11.39) mg/kg]，然而藜麥在發(fā)酵前幾乎檢測不到槲皮素，但經(jīng)發(fā)酵后，槲皮素的含量[(113.4±8.73) mg/kg]顯著增加，說明在發(fā)酵過程中許多槲皮素衍生物的糖苷鍵被破壞，形成了游離態(tài)的槲皮素。同時，發(fā)酵后的藜麥中含量較多的香草酸(44.7±2.54)mg/kg，藜麥中香草酸常常以結(jié)合態(tài)形式存在，一般不易提取[14]，本試驗通過微生物處理可有效將藜麥中部分結(jié)合態(tài)的香草酸釋放，易于機(jī)體的吸收利用。

1. 蘆丁 2. 槲皮素 3. 香草酸 圖4 藜麥提取物液相色譜圖Figure 4 The liquid chromatogram of extraction from quinoa

2.4 抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基的清除作用 由圖5可知，隨著質(zhì)量濃度的增加，樣品對DPPH自由基的清除效果增強(qiáng)，并在試驗濃度范圍內(nèi)呈一定的線性關(guān)系，R2分別為0.966 7(發(fā)酵藜麥)和0.995 2(未發(fā)酵藜麥)，同時藜麥經(jīng)發(fā)酵后提取所得樣品對DPPH自由基的清除率均顯著高于未發(fā)酵藜麥提取物的(P>0.01)，其IC50值分別為16.42，39.48 mg/mL，說明發(fā)酵處理可提高藜麥中的抗氧化活性成分，研究[1]表明，藜麥中主要的酚類抗氧化活性成分為蘆丁、槲皮素、香草酸和阿魏酸等，如2.3結(jié)果所示，發(fā)酵后藜麥中主要的酚類物質(zhì)含量顯著提高，因此增強(qiáng)了其自由基清除能力。

2.4.2 ABTS自由基的清除作用 由圖6可知，與DPPH自由基清除效果相似，樣品清除ABTS自由基的能力隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，發(fā)酵處理可顯著提高藜麥提取物對ABTS自由基的清除能力，平均可增加31.97%的清除率，其IC50分別為1.51，6.66 mg/mL，提高了4.4倍。

圖5 藜麥對DPPH自由基的清除作用Figure 5 The DPPH free radical scavenging activity of quinoa

圖6 藜麥對ABTS自由基的清除作用Figure 6 The ABTS free radical scavenging activity of quinoa

2.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性

α-葡萄糖苷酶是一種位于腸膜表面，可以分解碳水化合物，釋放出葡萄糖的消化酶，抑制該酶的活性可有效降低餐后血糖水平，調(diào)節(jié)糖化學(xué)代謝[15]。由圖7可知，藜麥發(fā)酵處理可顯著提高其對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，相對于未發(fā)酵的樣品，抑制率平均可提高12.41%。研究[16-17]表明，天然活性成分，如蘆丁、槲皮素等均具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，而藜麥中則富含這些物質(zhì)，并且經(jīng)發(fā)酵后，槲皮素的含量顯著增加，因此表現(xiàn)出更好的α-葡萄糖苷酶抑制作用。

3 結(jié)論

本研究以總酚含量為評價指標(biāo)，利用響應(yīng)面法優(yōu)化了藜麥發(fā)酵工藝條件：菌種添加量1.7%，發(fā)酵時間80 h，水分添加量16 mL，各因素對藜麥發(fā)酵過程中總酚含量影響的程度依次為：菌種添加量>水分添加量>發(fā)酵時間。在此條件下，藜麥發(fā)酵后總酚平均含量為(5.31±0.11) mg/g，與模型預(yù)測值之間的相對誤差僅為1.12%。藜麥經(jīng)發(fā)酵處理后，可顯著提高其中槲皮素和香草酸的含量，而對蘆丁含量幾乎沒有影響。同時，發(fā)酵處理可以大大提高藜麥的抗氧化活性。藜麥發(fā)酵后對DPPH自由基的清除率顯著提高，IC50為16.42 mg/mL，遠(yuǎn)小于未發(fā)酵的39.48 mg/mL；對ABTS自由基的清除效果同樣也顯著增加，提高了4.4倍。此外，發(fā)酵處理后，藜麥對α-葡萄糖苷酶的抑制作用也顯著增強(qiáng)，抑制率平均提高了12.41%。

圖7 藜麥對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Figure 7 The α-glucosidase inhibiting activity of quinoa

有關(guān)藜麥發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究報道甚少，本試驗證實發(fā)酵處理可顯著提高藜麥中的總酚含量，同時也大大增強(qiáng)了其生物活性，可為深入開發(fā)藜麥功能性食品提供思路。后續(xù)將對發(fā)酵處理影響藜麥中總酚含量的作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。