，， ，，,2

(1.東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620； 2.紡織面料技術(shù)教育部重點實驗室，上海 201620)

1 引 言

水凝膠是一種通過共價鍵、氫鍵或范德華力等作用相互交聯(lián)而構(gòu)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、能在水中溶脹并保持大量水分而又不溶解的聚合物[1-3]。因其具有高含水量、柔軟靈活、優(yōu)異的生物相容性等性質(zhì)而被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如藥物控釋、隱形眼鏡、創(chuàng)傷敷料和組織工程支架等[4-6]。海藻酸鈉是一種提取自海藻的天然多糖，是由β-D-甘露糖醛酸(M單元)與α-L-古羅糖醛酸(G單元)依靠β-1,4-糖苷鍵連接形成的線性共聚物。海藻酸鈉具有良好的生物相容性、可降解性，且經(jīng)濟環(huán)保，已經(jīng)在食品工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[7]。海藻酸鈉溶液可以通過添加二價陽離子(如Ca2+、Ba2+等)形成水凝膠，而且凝膠轉(zhuǎn)變條件溫和[8]。

聚乙烯醇是聚醋酸乙烯酯水解得到的水溶性聚合物，安全無毒。在形成凝膠過程中，聚乙烯醇分子鏈間羥基的氫鍵作用可形成纏繞結(jié)構(gòu)，使凝膠具有優(yōu)異的力學(xué)性能[9]。將聚乙烯醇引入海藻酸鹽水凝膠可以提高海藻酸鹽水凝膠的力學(xué)性能，從而實現(xiàn)海藻酸鈉和聚乙烯醇的性能互補。海藻酸鹽/聚乙烯醇水凝膠兼具海藻酸鈉良好的生物相容性、親水性和PVA優(yōu)異的機械性能，具有較廣泛的應(yīng)用前景[10-11]。通常，海藻酸鈣/聚乙烯醇水凝膠的制備方法是先將聚乙烯醇和海藻酸鈉溶液經(jīng)過冷凍-解凍操作形成半互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，然后再通過浸泡CaCl2的方式進行離子交聯(lián)形成海藻酸鈣/聚乙烯醇互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠[12]。這種方法在實際操作中，由于Ca2+與海藻酸的結(jié)合速度非?？?，容易形成局部凝膠，而且凝膠表面的致密層限制了Ca2+的滲透，導(dǎo)致凝膠內(nèi)部交聯(lián)程度的差別，最終難以得到均勻規(guī)整的水凝膠。

本文通過鈣離子原位釋放交聯(lián)的海藻酸鈉與凍融循環(huán)交聯(lián)的聚乙烯醇形成互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)來制備海藻酸鈣/聚乙烯醇水凝膠。首先將Ca2+與乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na·2H2O)螯合，并均勻分布于海藻酸鈉和聚乙烯醇的混合溶液中，然后通過D-葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL)的水解，從螯合體系中釋放出來的Ca2+與海藻酸鈉形成離子交聯(lián)。海藻酸鈉離子交聯(lián)的同時，對混合溶液進行凍融循環(huán)操作從而得到海藻酸鈣/聚乙烯醇水凝膠。該制備方法克服了浸泡CaCl2法交聯(lián)不均勻的缺點，得到的水凝膠交聯(lián)更加均勻，具有均一規(guī)整且孔隙率較高的多孔結(jié)構(gòu)，為水凝膠優(yōu)異的吸水保濕性提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也能夠保持水凝膠良好的力學(xué)彈性。

2 實驗部分

2.1 實驗試劑

聚乙烯醇(含量≥99%)、海藻酸鈉(CP)、乙二胺四乙酸二鈉(AR)；D-葡萄糖酸內(nèi)酯(AR)；氯化鈣(AR)；氫氧化鈉(AR)。

2.2 水凝膠的制備

2.2.1Ca-EDTA緩沖溶液的配制 將3.73g EDTA-2Na·2H2O分散于一定體積的蒸餾水中，攪拌使其充分溶解后再緩慢加入1.11g CaCl2固體，超聲使其完全溶解，Ca2+與EDTA摩爾比為1∶1。最后采用1M NaOH將混合溶液的pH調(diào)至7.0，制成100mL 0.1 M的Ca-EDTA溶液備用[3]。

2.2.2CA/PVA水凝膠的制備 準確稱取海藻酸鈉粉末溶于蒸餾水中，配制一定濃度的海藻酸鈉溶液，放置過夜使其完全溶解后備用。準確稱取聚乙烯醇，并加入蒸餾水，95℃以上水浴加熱溶解均勻后備用。室溫下，將上述海藻酸鈉溶液和聚乙烯醇溶液混合均勻后，加入一定體積的Ca-EDTA溶液和現(xiàn)配的GDL溶液，Ca-EDTA和GDL的摩爾比為1∶2，攪拌均勻后將混合溶液倒入模具內(nèi)。然后將模具放入冰箱冷凍12h，室溫下解凍。重復(fù)凍融過程，使得PVA 能夠充分交聯(lián)得到CA/PVA水凝膠。CA水凝膠為海藻酸鈉含量為2wt%的純海藻酸鈉水凝膠，不經(jīng)過凍融循環(huán)操作；PVA水凝膠含有7wt%的PVA，只進行凍融循環(huán)操作。

2.3 凝膠分數(shù)的測定

取定量的水凝膠樣品干燥至恒重，稱取其質(zhì)量(W0)，將其放入去離子水中，室溫下浸泡3天以除去未反應(yīng)的單體。然后再將其干燥至恒重，稱取質(zhì)量(W1)，計算凝膠分數(shù)。每個系列樣品至少測試3次，結(jié)果取平均值。凝膠分數(shù)(GF)按式(1)計算[13]：

(1)

2.4 形貌觀察

將冷凍干燥后的水凝膠樣品，在液氮中淬斷，對其橫斷面進行噴金處理，采用TM-1000型掃描電子顯微鏡(SEM)觀察水凝膠的微觀形貌。

2.5 性能測試

2.5.1熱穩(wěn)定性測試 采用TG209 F1型熱重分析儀對冷凍干燥后的水凝膠樣品進行熱穩(wěn)定性分析。將3.0mg左右待測樣品放置于開放的鋁盤里，在氮氣氛圍中，氣體流速設(shè)定為20mL/min，將樣品在50～700℃范圍內(nèi)勻速升溫，升溫速度為10℃/min，記錄熱失重變化曲線。

2.5.2吸水保濕性測試 將制備的水凝膠樣品干燥至恒重(Wd)放入去離子水中，室溫下保持一定時間后取出，用濾紙擦干表面的水分，記錄下此時水凝膠的質(zhì)量(Wt)，水凝膠的吸水溶脹比(SR)按式(2)計算[13]：

(2)

將溶脹平衡的水凝膠樣品放在25℃，濕度為60%的恒溫恒濕箱中，每隔一段時間取出稱重，記為Wt，通過含水量的動態(tài)變化來表征水凝膠的保水性能。含水量(WC)按式(3)計算[14]：

(3)

2.5.3動態(tài)流變性測試 將制備的水凝膠使用裁刀切割成直徑25mm，厚度2mm的圓片，于ARES-RFS型旋轉(zhuǎn)流變儀上測定其流變性能。選用直徑為25mm的平行板測量系統(tǒng)在25℃下進行測試。首先測試水凝膠在6.28Hz時的應(yīng)變掃描曲線，然后在應(yīng)變線性區(qū)內(nèi)對凝膠進行動態(tài)頻率(0.1～100Hz)掃描。

2.5.4拉伸性能測試 將水凝膠切成長條狀(40×10mm)在H5K-S型萬能材料試驗機上進行拉伸測試，拉伸速率為50mm/min，至樣品斷裂時停止。每個系列樣品至少測試3次，結(jié)果取平均值。水凝膠的拉伸強度為凝膠最大拉伸應(yīng)力與樣品截面面積的比值；斷裂伸長率為拉伸斷裂時樣品形變長度與初始長度的比值。

2.5.5CKK-8細胞毒性測試 采用豬髖內(nèi)皮細胞(PIEC)測試水凝膠浸提液的細胞毒性，測試時長24 h。將冷凍干燥后的水凝膠樣品，切成10×10mm大小，放入含有10%胎牛血清、青霉素100U/mL及鏈霉素100U/mL的DMEM培養(yǎng)基中，37℃下浸提24h。同時，在96孔板中接種100μL細胞密度為5×103/mL的細胞懸液，將培養(yǎng)板放于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h。然后更換新的培養(yǎng)基，并向?qū)嶒灲M中加入30μL浸提液，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中孵育1天。最后，向每孔加入含10% CKK-8的無血清DMEM培養(yǎng)基，放于培養(yǎng)箱中孵育1小時后，用酶標儀測定在450nm處的吸光度。以DMEM培養(yǎng)基作為對照組(Control)。

3 結(jié)果與討論

3.1 水凝膠的制備條件對凝膠分數(shù)的影響

水凝膠的結(jié)構(gòu)與性能一方面取決于高分子材料的種類及性質(zhì)，另一方面取決于水凝膠的制備條件。本研究采用鈣離子原位釋放法和凍融循環(huán)法相結(jié)合制備海藻酸鈣/聚乙烯醇(CA/PVA)互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠，機理如圖1所示。首先將Ca2+與EDTA-2Na螯合，并均勻分布于海藻酸鈉與聚乙烯醇的混合溶液中，然后通過GDL的水解，Ca2+逐漸從螯合體系中釋放出來并與海藻酸鈉形成離子交聯(lián)。同時，對混合溶液進行凍融循環(huán)操作從而得到海藻酸鈣/聚乙烯醇水凝膠。Ca2+含量和凍融循環(huán)次數(shù)等都會影響水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，最終影響水凝膠的各項性能。水凝膠制備條件對其結(jié)構(gòu)的影響反映在網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)程度及均勻性上，本文采用凝膠分數(shù)(Gel fraction)來表征制備條件對水凝膠交聯(lián)程度的影響。

圖1 CA/PVA水凝膠制備機理Fig.1 Schematic illustration of CA/PVA hydrogels

固定海藻酸鈉用量為2wt%，PVA為7wt%，Ca-EDTA與GDL摩爾比為1∶2，凍融循環(huán)3次，通過改變Ca2+的用量(5、10、15、20 mM)，來探究Ca2+用量對凝膠分數(shù)的影響。圖2為不同Ca2+制備水凝膠的凝膠分數(shù)變化曲線，可以看出水凝膠的凝膠分數(shù)隨著Ca2+用量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。Ca2+可對海藻酸鈉進行離子交聯(lián)，使得海藻酸鈉在水凝膠中起到很好的支架作用，與PVA形成完善的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。采用Ca2+原位釋放法可以保證Ca2+在凝膠混合溶液中均勻分布，從而使得所制備的水凝膠具有均勻分散的交聯(lián)點，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)規(guī)整一致。隨著Ca2+用量的增加，海藻酸鏈的有效交聯(lián)越多，形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越完善規(guī)整，所以凝膠分數(shù)增加。但是在海藻酸鈉含量一定的情況下，繼續(xù)增加Ca2+用量，離子交聯(lián)迅速增加，交聯(lián)點增多，一定程度上限制PVA分子鏈的移動，從而阻礙PVA分子鏈間氫鍵的形成，所以凝膠分數(shù)減小。

圖2 Ca2+含量對CA/PVA水凝膠凝膠分數(shù)的影響Fig.2 Effect of Ca2+concentration on the gel fraction of CA/PVA hydrogels

圖3 凍融循環(huán)次數(shù)對CA/PVA水凝膠凝膠分數(shù)的影響Fig.3 Effect of freeze-thawing times on the gel fraction of CA/PVA hydrogels

固定海藻酸鈉用量為2wt%，PVA為7wt%，Ca-EDTA與GDL摩爾比為1∶2，Ca2+的用量為10mM，通過改變凍融循環(huán)次數(shù)(2、3、4、5)，來探究凍融循環(huán)次數(shù)對凝膠分數(shù)的影響。圖3為不同凍融循環(huán)次數(shù)下水凝膠的凝膠分數(shù)變化曲線?？梢钥闯?，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，水凝膠的凝膠分數(shù)逐漸增大，凍融4次后凝膠分數(shù)增勢趨緩，說明水凝膠已形成完善的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。PVA分子鏈經(jīng)冷凍后，分子鏈內(nèi)和分子鏈間的羥基接觸，形成交聯(lián)節(jié)點。而未發(fā)生交聯(lián)的PVA分子鏈在解凍后仍具有一定的運動能力，這使得相互接觸的羥基經(jīng)再次冷凍后形成新的交聯(lián)節(jié)點[15]。因此，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，PVA的交聯(lián)密度增大，PVA分子鏈和海藻酸鈉分子鏈共同形成致密的三維網(wǎng)格，水凝膠的凝膠分數(shù)增加。多次凍融循環(huán)后，PVA分子鏈交聯(lián)點基本固定，活動性減弱，所以繼續(xù)增加凍融循環(huán)，凝膠分數(shù)增大趨勢不明顯。

3.2 形貌分析

圖4是CA水凝膠，PVA水凝膠和CA/PVA水凝膠的SEM圖。由圖4a可見，CA水凝膠具有疏松均勻的開孔結(jié)構(gòu)，孔隙相互貫通，孔徑分布范圍為100～200μm，孔壁規(guī)整。PVA水凝膠(圖4b)也具有多孔結(jié)構(gòu)，但多孔結(jié)構(gòu)更加緊湊，孔徑尺寸明顯減小，孔密度較高。CA/PVA水凝膠(圖4c)的多孔結(jié)構(gòu)兼具前兩者的優(yōu)勢，具有規(guī)則均勻的多孔結(jié)構(gòu)，孔洞相互貫通，孔隙率較高，孔徑尺寸居中，沒有明顯的微相分離，這表明海藻酸鈉和PVA大分子鏈具有很好的相容性。Ca2+原位釋放和多次凍融循環(huán)的結(jié)合使得水凝膠具有均一的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而使得多孔結(jié)構(gòu)均勻規(guī)整。海藻酸鈉分子鏈通過Ca2+離子交聯(lián)作用后，在水凝膠中起到很好的支架作用，使得水凝膠的孔洞變大，同時又兼具PVA緊密纏繞的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。CA/PVA水凝膠均勻多孔的骨架結(jié)構(gòu)不僅提供了水分子進出水凝膠的通道，為水凝膠優(yōu)異的吸水保濕性能提供了一定的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也使得水凝膠保持良好的力學(xué)彈性。

圖4 水凝膠的掃描電鏡照片 (a) CA水凝膠； (b) PVA水凝膠； (c) CA/PVA水凝膠Fig.4 SEM images of hydrogels: (a) CA; (b) PVA; (c) CA/PVA

3.3 水凝膠性能研究

3.3.1熱穩(wěn)定性 圖5為三種水凝膠的熱失重曲線，三種水凝膠具有不同的熱分解曲線，其熱穩(wěn)定性各不相同。熱分解第一階段發(fā)生在30～100℃之間，CA水凝膠對應(yīng)于熱重曲線上有10%的失重，即為分子內(nèi)結(jié)合水的丟失，而CA/PVA水凝膠，PVA水凝膠在這一階段的失重依次減少，這說明水凝膠內(nèi)部所含結(jié)合水依次減少。在快速分解階段，CA/PVA水凝膠的起始分解溫度居中，PVA水凝膠結(jié)晶結(jié)構(gòu)最多，熱穩(wěn)定性最好，這說明PVA的加入能有效提高海藻酸鈉水凝膠的熱穩(wěn)定性。

圖5 水凝膠的熱失重分析 (a) CA水凝膠； (b) CA/PVA水凝膠； (c) PVA水凝膠Fig.5 TGA curves of hydrogels (a) CA; (b) CA/PVA; (c) PVA

3.3.2吸水保濕性 圖6為不同PVA含量的CA/PVA水凝膠的動態(tài)吸水與保濕性能。由圖6(a)可看出，在吸水溶脹開始的前3h內(nèi)，凝膠快速吸水，吸水溶脹率增加較快，隨著溶脹時間的延長，溶脹率增加緩慢，最終趨于平衡。同時可得出結(jié)論，隨著PVA含量的增加，水凝膠的溶脹性逐漸減弱，所以可以通過控制水凝膠中PVA的含量來控制水凝膠的溶脹性。由圖6(b)可看出，在保水性測試開始后的前3h內(nèi)，水凝膠保水性較好，含水量減小較少，隨著時間的延長，水凝膠的吸水保濕性變差，含水量迅速減少，但在PVA含量低于9wt%時，水凝膠的8h時含水量仍保持在50%以上，這說明CA/PVA水凝膠具有較好的保濕性。

3.3.3動態(tài)流變性 圖7為CA/PVA水凝膠在0.1%應(yīng)變下儲能模量G′隨頻率變化的曲線?？梢钥闯鲈谡麄€頻率范圍內(nèi)，不同CA/PVA水凝膠的G′各不相同，并且G′不依賴于頻率變化。儲能模量G′是衡量材料剛度的一個重要參數(shù)，水凝膠的G′越大，其強度越高[16]。由圖7a可看出，CA水凝膠儲能模量較低，添加2wt%的PVA后，水凝膠的強度顯著增加。而且隨著水凝膠中PVA含量的增加，水凝膠的G′呈現(xiàn)增加趨勢，即水凝膠的強度增大。由圖7b可看出，隨著水凝膠凍融循環(huán)次數(shù)的增加，水凝膠的強度逐漸增大。這與凝膠分數(shù)測試的結(jié)果一致，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，水凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加完善，從而強度增大。

圖7 CA/PVA水凝膠儲能模量G′隨頻率變化曲線 (a) 不同PVA含量的CA/PVA水凝膠； (b) 不同凍融循環(huán)次數(shù)下CA/PVA水凝膠Fig.7 Storage modulus of hydrogels as functions of frequencys (a) CA/PVA hydrogels with different PVA content; (b) CA/PVA hydrogels with different freeze-thawing times

3.3.4拉伸性能 對所制備CA/PVA水凝膠進行拉伸性能測試，結(jié)果如圖8所示。圖8a為不同PVA含量的CA/PVA水凝膠的拉伸強度和斷裂伸長率。當(dāng)PVA含量為0時，水凝膠的強度較低，無法進行拉伸性能測試。隨著PVA含量的增加，水凝膠的拉伸強度不斷增強。這是由于PVA分子鏈經(jīng)過凍融循環(huán)操作后，發(fā)生大量分子內(nèi)、分子間氫鍵作用，從而與海藻酸鈉分子鏈形成互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，起到機械增強作用。隨著PVA含量的增加，水凝膠的交聯(lián)密度增加使得水凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊密，從而受到外力作用時，應(yīng)力可以被均勻分散，拉伸強度和斷裂伸長率均有所增加。圖8b為不同凍融循環(huán)次數(shù)后的CA/PVA水凝膠的拉伸強度和斷裂伸長率?？煽闯?，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，水凝膠的拉伸強度和斷裂伸長率顯著增大。這是由于PVA分子鏈間、分子內(nèi)氫鍵作用力隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加而增大，PVA的交聯(lián)密度增大，分子鏈的規(guī)整性較好，水凝膠形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。規(guī)整的交聯(lián)結(jié)構(gòu)使得水凝膠抵御外力作用的能力加強，從而拉伸強度和斷裂伸長率均有所增加，這一結(jié)果與凝膠分數(shù)、流變測試結(jié)果一致。

3.3.5細胞毒性 圖9為豬髖內(nèi)皮細胞的細胞毒性實驗結(jié)果。采用OD值的大小來表征細胞存活率的大小，OD值越高，細胞存活率越高。由圖9可看出，三種水凝膠樣品的浸提液均對豬髖內(nèi)皮細胞的存活率沒有消極影響。和對照組相比，三種水凝膠的浸提液所測得的OD值并未減少，這說明三種水凝膠均無細胞毒性，具有很好的細胞相容性。海藻酸鈉是生物相容性較好的天然多糖，聚乙烯醇是安全無毒的水溶性聚合物，并且制備過程中并無使用有毒物質(zhì)，所以所制備的水凝膠不僅安全無毒，而且細胞相容性較好，有利于細胞增殖。

圖8 CA/PVA水凝膠拉伸性能 (a) 不同PVA含量下CA/PVA水凝膠； (b) 不同凍融循環(huán)次數(shù)下CA/PVA水凝膠Fig.8 Tensile properties of CA/PVA hydrogels (a) CA/PVA hydrogels with different PVA content; (b) CA/PVA hydrogels with different freeze-thawing times

圖9 水凝膠的細胞存活率Fig.9 Cell viabilities of hydrogels

4 結(jié) 論

通過在海藻酸鈉水凝膠中引入聚乙烯醇組分來構(gòu)建互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可以制備得到具有優(yōu)異生物相容性、吸水保濕性和拉伸性能的海藻酸鈣/聚乙烯醇水凝膠。采用Ca2+從螯合體系中緩慢釋放的方法使海藻酸鈉的交聯(lián)更加均勻，所形成水凝膠的微孔分布更加均一，為水凝膠優(yōu)異的吸水保濕性提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也使得水凝膠能夠保持良好的力學(xué)彈性。鈣離子原位釋放法和凍融循環(huán)法的有效結(jié)合使得所制備水凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加均勻規(guī)整，能進一步拓寬海藻酸鈣/聚乙烯醇水凝膠的應(yīng)用領(lǐng)域。