(山西農業(yè)大學動物科技學院，山西 太谷 030801)

0 引言

PRRSV屬于套式病毒目(Nidovirales)，動脈炎病毒科(Arteriviridae)， 動脈炎病毒屬，是帶囊膜結構的單股正鏈RNA病毒[1]。ORF基因編碼病毒的N端糖基化囊膜蛋白(GP5蛋白)，是重要的結構蛋白和免疫保護性抗原蛋白，參與細胞免疫與體液免疫[2]。

1 材料與方法

1.1 豬PRRSV GP5蛋白基因的優(yōu)化和合成

根據(jù)Genbank中的豬PRRSV ATCC VR-2332株的GP5蛋白的序列，去除其31個AA的信號肽后，對其進行密碼子優(yōu)化，并在序列兩端加入BamH I和Sal I限制性內切酶位點，優(yōu)化后的序列交由上海生工生物技術公司合成。

1.2 pCold-GP5重組質粒的構建及鑒定

用質粒小提試劑盒提取重組質粒，進行雙酶切鑒定，酶切體系為：10XFD FastDigest buffer 5 μL，BamH I 2.5 μL，Sal I 2.5 μL，重組質粒40 μL。反應結束后，對酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3 重組BL21的構建及鑒定

取2 μL 重組質粒pCold-GP5加入到100 μL的BL21，冰浴20 min，42℃熱激90 s;冰浴3 min，加入500 μL LB培養(yǎng)基，37℃孵育30 min后，取100 μL涂布到含有Amp的LB平板，37℃，過夜培養(yǎng)。隨機挑取6個單克隆，進行PCR鑒定。反應結束后，對PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 重組GP5蛋白的誘導表達及鑒定

誘導的菌液4 000 rpm離心10 min，用50 mL緩沖液(100 mM Tis-Hcl， 50 mM NaCl)重懸菌體，超聲破碎菌體，12 000 rpm離心30 min，收集上清，0.22 μm 濾膜過濾，進行SDS-PAGE和Western blotting檢測。

2 結果

2.1 重組質粒pCold-GP5的鑒定

將構建成功的重組質粒pCold-GP5，經 BamH I 和Sal I 雙酶切后， 1%瓊脂糖凝膠電泳，圖 1顯示酶切片段約為522 bp，與預計大小相符。

圖1 重組質粒pCold-GP5的雙酶切鑒定

2.2 重組BL21的鑒定

1%瓊脂糖凝膠電泳如圖2，在500 bp與750 bp之間有單一條帶，與522 bp的GP5蛋白基因大小符合，說明挑選的重組BL21單菌落含有GP5蛋白基因。

圖2 重組BL21的PCR鑒定

2.3 重組GP5蛋白的鑒定

結果如圖3所示，19kD處有一明顯條帶，與預期大小一致。SDS-PAGE和Western Blot結果證明， GP5蛋白表達成功。

圖3 表達產物的SDS電泳和Western blotting結果

3 討論

稀有密碼子會降低目的基因的轉錄水平，合適的密碼子替換可以提高外源基因在宿主中的表達量[7]。

本研究為了提高GP5蛋白的產量，將GP5基因序列的密碼子優(yōu)化為大腸桿菌偏愛的密碼子，構建了重組BL21菌株，利用IPTG誘導表達，表達產物經SDS-PAGE和Western bloting驗證，成功獲得了重組GP5蛋白。