李德靈

無限極（中國）有限公司

1.前言

近年來，我國工業(yè)化進(jìn)程的加速，環(huán)境污染加劇以及快速的生活節(jié)奏和與日俱增的生存壓力，導(dǎo)致各種慢性疾病的患病率越來越高。以癌癥為例，2017年的癌癥統(tǒng)計資料顯示，在中國，每年新發(fā)癌癥病例達(dá) 429 萬，占全球新發(fā)病例的 20% ，死亡 281 萬例[1]。癌癥防治已成為我國重要公共衛(wèi)生問題。其實，癌癥的發(fā)病也是由于人體免疫力下降導(dǎo)致[2]。提高人體免疫能力是抗癌的關(guān)鍵[2]。

我國許多中草藥具有提高免疫功能，比如靈芝、薏苡仁、茯苓、白術(shù)、菟絲子、黃精、麥冬、甘草和枸杞子等等[3]。市面上有很多提高免疫功能的保健品用其中一種或幾種原料制成產(chǎn)品。本實驗用的膠囊產(chǎn)品以靈芝、薏苡仁、茯苓、白術(shù)、菟絲子、黃精、麥冬、甘草、枸杞子中藥材等精制而成。這種復(fù)合產(chǎn)品是具具有提高免疫并具有抗腫瘤作用，未見報道。

本實驗擬采用動物實驗對這一產(chǎn)品的促進(jìn)免疫功能及抗腫瘤功能進(jìn)行研究。

2.實驗材料與試劑

一款膠囊產(chǎn)品由無限極（中國）有限公司提供。實驗動物來自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。脫纖維綿羊血、Hank's液、ConA 液、RPMI1640培養(yǎng)液、MTT、綿羊紅細(xì)胞、脫酸脫氫酶基質(zhì)液和S180細(xì)胞株，來自廣州齊云生物科技有限公司；異丙醇、Na2CO3、冰醋酸、臺酚藍(lán)、NP40和Triton來自廣州化學(xué)試劑廠。

3.實驗方法

3.1 增強(qiáng)免疫功能實驗[4]

3.1.1實驗動物、劑量分組及受試樣品給予時間

取SPF級ICR小鼠252只，雌性，體重18～22 g，分成3批進(jìn)行試驗，分別進(jìn)行DTH和血清溶血素實驗，碳粒廓清實驗，小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗和NK細(xì)胞活性測定實驗。每批小鼠均分成5組，每組12只，分別為：陰性對照組，模型對照組，樣品低、中、高劑量組（150，300，600mg/kg）。適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后正式試驗，連續(xù)給藥30 d，經(jīng)口灌胃給予小鼠受試物。

3.1.2 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)

取新鮮的脫纖維羊血，生理鹽水洗滌3次（1000 rpm，10 min），每只小鼠腹腔注射2%壓積綿羊紅細(xì)胞（SRBC）0.2 mL，致敏后4 d，測量左后小鼠足趾厚度，同一部位測量三次，取平均值。然后在測量部位用20 μL 20%的SRBC進(jìn)行第二次免疫，24 h后測量相同部位厚度，計算二次免疫前后足趾厚度差值。

3.1.3 ConA 誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗

無菌取脾，置于盛有適量（3-5ml）無菌Hank's液平皿中，并在脾上面放置一塊紗布，用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎，制成單個細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hank's液洗2次，每次離心10 min（1000 r/min）。然后將細(xì)胞懸浮于2 mL的完全培養(yǎng)液中，用全自動細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)脾細(xì)胞，或用臺酚藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù)（應(yīng)在95%以上），調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個/mL。

將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，一孔加75 μl ConA 液（相當(dāng)于7.5μg/mL），另一孔作為對照，置5%CO2，37℃孵箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔輕輕吸去上清液0.7mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時加入MTT（5mg/mL）50 μl /孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1mL酸性異丙醇，超聲震蕩（2秒）或人工吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個孔分裝3孔作為平行樣，用酶聯(lián)免疫檢測儀，以570 nm波長測定光密度值。也可將溶解液直接移入2 mL比色杯中，分光光度計上在波長570 nm測定OD值。

用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能力，受試樣品組的光密度差值顯著高于對照組的光密度差值，可判定該項實驗結(jié)果陽性。

3.1.4 血清溶血素抗體積數(shù)的測定

試驗第26-27天，將壓積綿羊紅細(xì)胞（Sheep red blood cells, SRBC）用生理鹽水配成2%（v/v）的細(xì)胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2 mL進(jìn)行免疫。第31天后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h，3000 r/min離心10 min，收集血清。取U型底的96孔板每孔加入100 μL PBS緩沖液，然后在第一孔加入100 μL小鼠血清吹打均勻，再從第一孔取100 μL到第二孔吹打均勻，再從第二孔取100 μL到第三孔吹打均勻，以此類推進(jìn)行2倍稀釋，最后一孔取出100 μL棄去，每孔加入100 μL 0.5%(v/v)的SRBC懸液（SA稀釋），混勻，放入生化培養(yǎng)箱37℃溫箱孵育3 h，觀察血球凝集程度，計算抗體積數(shù)。

3.1.5 碳粒廓清實驗

所有小鼠通過尾靜脈注射0.2 mL稀釋印度墨汁，計時2、10 min，分別取小鼠內(nèi)眥靜脈血20 μL加入到2 mL0.1%Na2CO3溶液防止發(fā)生凝集。以0.1%Na2CO3溶液作空白對照，在600 nm波長處測OD值。t1表示2 min，t2表示10 min，OD1表示2 min所取靜脈血的光密度值，OD2表示10 min所取靜脈血的光密度值。頸椎脫臼處死小鼠，解剖，取肝臟和脾臟稱重記錄，按下式計算吞噬指數(shù)a。

3.1.6 NK細(xì)胞活性測定: 乳酸脫氫酶測定法

實驗前24 h將靶細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。應(yīng)用前以Hank's液洗3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個/mL。

無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's液的小平皿中，并在脾上面放置一塊紗布，用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎，制成單個細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hank's液洗2次，每次離心10 min（1000r/min）。棄上清將細(xì)胞漿彈起，加入0.5 mL滅菌水20秒，裂解紅細(xì)胞后再加入0.5 mL 2倍Hank’s液及8mL Hank’s液，1000 rpm，10 min離心，然后將細(xì)胞懸浮于2 mL的完全培養(yǎng)液中，用全自動細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)脾細(xì)胞；或用1 mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，用1%冰醋酸稀釋后計數(shù)(活細(xì)胞數(shù)應(yīng)在95%以上)，用臺酚藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù)（應(yīng)在95%以上），最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個/mL。

取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100μl（效靶比50:1），加入U型96孔培養(yǎng)板中；靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100μl，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1%NP40或2.5% Triton各100μl ；上述各項均設(shè)三個復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后將96孔培養(yǎng)板以1500r/min離心5min，每孔吸取上清100μl置平底96孔培養(yǎng)板中，同時加入乳酸脫氫酶基質(zhì)液100μl，反應(yīng)3min，每孔加入1mol/L的HCl 30μl，在酶標(biāo)儀490nm處測定光密度值（OD）。

按下式計算NK細(xì)胞活性，受試樣品組的NK細(xì)胞活性顯著高于對照組的NK細(xì)胞活性，即可判定該項實驗結(jié)果陽性。

3.2 抗腫瘤功能研究

3.2.1 實驗動物、劑量分組及受試樣品給予時間

清潔級昆明種小鼠，雄性，18～22g，每組12只，共5組：模型對照組、樣品低、中、高劑量組（150、300、600 mg/kg·bw），陰性對照組給予蒸餾水，連續(xù)10d，受試物每天定時經(jīng)口灌胃各劑量組。

3.3.2 抗腫瘤實驗

將復(fù)蘇的S180細(xì)胞株（0.2mL/只）接種到昆明種小鼠腹腔內(nèi)，第7d時選取生長良好的S180肉瘤細(xì)胞荷瘤鼠腹水，呈乳白色，按1:4加入無菌生理鹽水稀釋。同樣的方法（0.2mL/只），繼續(xù)傳兩代。選取生長良好的第二代荷瘤鼠腹水復(fù)制腫瘤動物模型。

無菌抽取6只荷瘤鼠腹水，混合，按1:4加入無菌生理鹽水稀釋。0.4%臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞懸液:0.4%臺盼藍(lán)=1:9，混勻后染色5min，顯微鏡下計數(shù)活細(xì)胞數(shù)，然后用無菌生理鹽水稀釋，調(diào)整活腫瘤細(xì)胞密度為1×107mL-1（冰浴中操作），按0.2mL/只接種于經(jīng)常規(guī)皮膚消毒后的待接種小鼠右前腋皮下，整個操作于30分鐘內(nèi)完成。

各用藥組于造模后24小時開始灌胃給藥，模型對照組灌胃蒸餾水。連續(xù)10d。末次給藥后24h，頸椎脫臼處死小鼠，剝離腫瘤、并取脾臟和胸腺稱重，計算各組動物的平均瘤重、抑瘤率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

抑瘤率 =（對照組平均瘤重－給藥組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%

脾臟指數(shù) = 脾臟重量 / 體重×100%

胸腺指數(shù) = 胸腺重量 / 體重×100%

4.實驗結(jié)果

4.1 增強(qiáng)免疫功能

4.1.1 樣品對小鼠體重、臟器比的影響

圖1 攝入樣品后小鼠的初重和末重

由圖1可知，與陰性對照組比較，經(jīng)口給予小鼠不同劑量樣品30 d，體重與陰性對照組比較均無顯著性差異（p＞0.05）。

圖2 攝入樣品后小鼠的臟器指數(shù)

由圖2可知，經(jīng)口給予小鼠不同劑量樣品30 d，脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)在各劑量組與陰性對照組間比較均無顯著性差異（p＞0.05）。

4.1.2 樣品對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）的影響

圖3 攝入樣品后小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)

由圖3可知，與陰性對照組比較，攝入樣品的三個劑量組均有極顯著性差異（p＜0.01）。

4.1.3 樣品對ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗的影響

由表1可知，與陰性對照組相比，樣品的三個劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞增值能力均增加（p＜0.01）。

表1 膠囊實驗小鼠MTT增值能力情況

圖4 樣品對小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

圖4中結(jié)果顯示樣品對淋巴細(xì)胞的增殖能力與陰性對照比具有極顯著增加（p＜0.01）。

4.1.4 樣品對小鼠抗體積數(shù)的影響

圖5 樣品攝入對小鼠抗體積數(shù)的影響

由圖5可知，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的樣品30 d，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，與陰性對照組比較，樣品的高劑量組有極顯著性差異（p＜0.01）。

4.1.5 樣品對小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳粒廓清能力的影響

圖6 樣品對小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳粒廓清能力的影響

由圖6可知，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的樣品30 d，與陰性對照組比較，樣品的三個劑量組小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)有一定的上升趨勢，中劑量組小鼠的碳粒廓清功能有顯著升高（p＜0.05），高劑量組小鼠有極顯著升高（p＜0.01）。

4.1.7 樣品對NK細(xì)胞活力的影響

表2 膠囊實驗小鼠NK細(xì)胞活力情況

由表2可知，與陰性對照組相比，樣品中、高劑量組具有極顯著性差異（p＜0.01）。

4.2 抗腫瘤功能

4.2.1.膠囊對荷瘤鼠體重及臟器指數(shù)的影響

表3 膠囊藥物對荷瘤鼠體重及臟器指數(shù)的影響

如表3所示，各組別之間初重、末重差異不存在顯著性（p＞0.05），各劑量組荷瘤鼠的免疫器官相對質(zhì)量高于模型對照組，各劑量組脾臟指數(shù)的增長不具有顯著性（p＞0.05）。

4.2.2 膠囊藥物對小鼠S180肉瘤抑瘤率的影響

表4 兩種膠囊藥物對小鼠S180肉瘤抑瘤率的影響

如表4所示，樣品各劑量組平均瘤重均低于模型組，且差異呈顯著性（p＜0.05）。說明樣品各劑量組均對小鼠S180肉瘤有抑制作用。

5.結(jié)論

樣品對小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)無明顯影響，但能增加小鼠足趾腫脹度、增加小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力、增加小鼠的抗體積數(shù)、能增強(qiáng)小鼠的碳粒廓清功能以及增加小鼠NK細(xì)胞活力，因此均能提高小鼠的免疫功能。同時，樣品也體現(xiàn)出不同程度的抑制S180肉瘤的生長。