李鵬

甘肅工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化工學(xué)院 甘肅天水 741025

沙棘（Hippopphae rhamnoides L.）為胡頹子科沙棘屬落葉灌木或小喬木，在我國(guó)分布廣泛[1]。沙棘黃酮是沙棘主要藥用成分[2]，廣泛存在于沙棘果、葉、莖、根等不同器官中，具有清除超氧陰離子自由基及羥自由基、防癌抗癌[3]等作用，目前，沙棘加工企業(yè)在加工沙棘濃縮汁、沙棘果醬、沙棘油等產(chǎn)品，產(chǎn)生大量的沙棘果渣，而且研究表明沙棘果渣中黃酮的含量也相當(dāng)高[4]，若將沙棘果渣中黃酮提取并進(jìn)行體外抗氧化活性研究，以期為開發(fā)新的天然抗氧化劑和合理利用沙棘資源提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)延伸沙棘加工產(chǎn)業(yè)鏈，提升沙棘開發(fā)利用的經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有積極意義。

本研究利用甘肅天水地區(qū)沙棘果渣下腳料為原料，通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)方法對(duì)沙棘果渣黃酮進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，以確定最佳的工藝條件。同時(shí)，以VC為對(duì)照，對(duì)沙棘果渣黃酮提取液對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基清除效果進(jìn)行測(cè)定，評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性的強(qiáng)弱。

1.材料與方法

1.1 儀器

紫外分光光度計(jì)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；恒溫水浴鍋；數(shù)控超聲波清洗器；酒精計(jì)；電子天平；高速臺(tái)式離心機(jī)；數(shù)顯恒溫水浴鍋；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 材料與試劑 沙棘果渣（昌盛食品有限責(zé)任公司提供）。

1.3 方法

1.3.1 沙棘果渣黃酮的提取

取沙棘果渣2g，精密稱定，加入體積分?jǐn)?shù)為60% 的乙醇30mL，60%功率超聲和一定時(shí)間提取類黃酮。提取液在20 ℃條件下8 000×g離心10 min，濾渣以同樣條件提取、離心、合并上清液，然后用乙醇溶液定容為100m L。

1.3.2 沙棘汁制備

總黃酮的測(cè)定方法

采用硝酸鋁絡(luò)合分光光度法測(cè)定黃酮含量[5]。

取沙棘果渣提取液1 m L，置于25 m L量瓶中，測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算質(zhì)量濃度，由質(zhì)量濃度計(jì)算沙棘果渣總黃酮提取率（%），按下式計(jì)算總黃酮提取率（%）。每個(gè)實(shí)驗(yàn)在相同條件下提取3 個(gè)平行樣。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%和80%共6個(gè)水平；料液比（g·mL-1）為l∶20、1∶30、l∶40、1∶50、1∶60和1∶70共6個(gè)水平；超聲波（超聲功率250 W)浸提時(shí)間為10、30、50、70、90 和110 min共6 個(gè)水平；提取次數(shù)為1、2、3 次和4次共4個(gè)水平，以沙棘果渣干粉為原料，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

例如在教學(xué)《中國(guó)石拱橋》時(shí)，為了讓學(xué)生了解中國(guó)橋梁建設(shè)的光輝成就，在教學(xué)時(shí)，我們可以組織學(xué)生在閱讀文本后回答下面幾個(gè)問(wèn)題，如：

1.3.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸提時(shí)間、提取次數(shù)，分別設(shè)計(jì)3個(gè)水平，以沙棘果渣為原料進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，確定沙棘果渣黃酮提取的最佳工藝條件。

1.3.5 沙棘果渣黃酮對(duì)羥自由基清除率的測(cè)定

將沙棘果渣黃酮提取液依次按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 和 1∶25 稀釋，得到不同質(zhì)量濃度的樣品醇溶物。精確吸取3 m L不同質(zhì)量濃度（0.509、0.768、0.914、1.691、3.318 mg·L-1 ）樣品醇溶物于試管中，依次向試管中加入2 m L 0.1 mol·L-1 FeSO4、2 m L 0.1 mol·L-1水楊酸、2 m L 0.1 mol·L-1 H2O2，用蒸餾水定容至10 m L并搖勻，在37 ℃條件下恒溫加熱30 min后在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度Aa；將體系中樣品用3 m L無(wú)水乙醇代替，在相同條件下測(cè)定其吸光度A0；將體系中H2O2用蒸餾水代替在相同條件下測(cè)定其吸光度Ab。用等質(zhì)量濃度的VC代替樣品做對(duì)照，按下式計(jì)算清除率（E）：

1.3.6 沙棘果渣黃酮對(duì)超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定

取5支10 m L離心管各加入pH 8.2的50 m mol/L Tris-HC1緩沖液4.5 m L，再分別加入果渣提取液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 m L，然后依次加蒸餾水0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 m L，混勻后在25 ℃恒溫水浴中保溫20 min，取出后立即加入在25 ℃預(yù)熱過(guò)的3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 m L啟動(dòng)反應(yīng)。5 min后加10 mol/L鹽酸溶液0.2 m L終止反應(yīng)。同時(shí)另取5支離心管，按上述步驟依次加入Tris-HCl緩沖液、黃酮提取液和蒸餾水，然后分別加10 m mol/L鹽酸溶液0.3 m L，5 min后加10 mol/L鹽酸溶液0.2 m L終止反應(yīng)，搖勻。在325 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。按照下式計(jì)算沙棘果渣黃酮提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率：

其中：A1為不含樣品的吸光度；A2為不含樣品和鄰苯三酚的吸光度；A3為含樣品的吸光度；A4為含樣品，但不含鄰苯三酚的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沙棘果渣黃酮提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加到60%之后，沙棘果渣總黃酮提取量有所下降，在正交試驗(yàn)中應(yīng)選擇50%～70%的乙醇作為優(yōu)化的參考范圍。

沙棘果渣黃酮提取量隨著料液比的增加而增加，料液比為1:20時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)料液比增加到1:40之后，其增加量對(duì)黃酮提取量的影響不大，料液比越大,溶劑用量越大，有利于黃酮的溶出，但當(dāng)達(dá)到最大的溶解度后黃酮類化合物基本提取完全，黃酮提取量不再增加，繼續(xù)增加料液比會(huì)造成溶劑和能源的浪費(fèi)，因此在進(jìn)行正交試驗(yàn)時(shí)，選擇1:20～1:40進(jìn)行優(yōu)化。

隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮提取率逐漸增加，且增幅明顯。當(dāng)浸提時(shí)間為50 min時(shí)，繼續(xù)延長(zhǎng)浸提時(shí)間，提取率以較小的平緩幅度增加，考慮到浸提時(shí)間越長(zhǎng)，能耗及經(jīng)濟(jì)成本越大，因此在進(jìn)行正交試驗(yàn)時(shí)，選擇50～90 min進(jìn)行優(yōu)化。

沙棘果渣黃酮提取量隨著提取次數(shù)的增多而增加，提取次數(shù)為4次時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)提取次數(shù)為3次之后，沙棘果渣黃酮提取量緩慢增加，但對(duì)提取量的影響不大。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析

選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。按照 4因素 3 水平正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行 9 次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)平行3次。正交實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 沙棘果渣黃酮提取正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表1可知，沙棘果渣黃酮提取的最佳配比組合A1B3C3D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比(1:40)，提取時(shí)間為90 min，提取次數(shù)為3次。極差分析表明，提取次數(shù)對(duì)沙棘果渣黃酮提取的影響最大，各因素對(duì)沙棘酸奶感官品質(zhì)影響主次為提取次數(shù)＞乙醇體積分?jǐn)?shù)60%＞料液比＞提取時(shí)間。

2.3 沙棘果渣黃酮提取液抗氧化活性

2.3.1 沙棘果渣黃酮提取液清除羥自由基能力分析

圖1 沙棘果渣黃酮提取液和VC對(duì)羥自由基的清除能力

結(jié)果表明，沙棘果渣黃酮提取液和VC清除羥自由基的能力與質(zhì)量濃度呈上升趨勢(shì)，黃酮提取液和VC對(duì)羥自由基的清除率分別為41.37%～43.52%和36.95%～39.10%。沙棘果渣黃酮提取液質(zhì)量濃度為3.318 mg·L-1時(shí)，清除率達(dá)到43.52%，明顯大于同等質(zhì)量濃度VC的清除率39.10%。

2.3.2 沙棘果渣黃酮提取液清除超氧陰離子自由基能力分析

圖2 沙棘果渣黃酮提取液和VC對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

結(jié)果表明，沙棘果渣黃酮提取液和VC清除羥自由基的能力與質(zhì)量濃度呈上升趨勢(shì)。黃酮提取液和VC對(duì)超氧陰離子自由基的清除率分別為46.89%～58.75%和63.26%～85.67%，說(shuō)明沙棘果渣黃酮提取液對(duì)超氧陰離子自由基有抑制作用，沙棘果渣黃酮提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率明顯小于同等質(zhì)量濃度VC。同時(shí)，沙棘果渣黃酮提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力明顯大于對(duì)羥自由基的清除能力。

3.結(jié)論

采用超聲波輔助提取法對(duì)甘肅天水地區(qū)沙棘果渣黃酮進(jìn)行了提取，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得到影響黃酮提取率的提取因素的影響力大小為：提取次數(shù)＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞料液比。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)沙棘果渣黃酮超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取條件為料液比為乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，提取時(shí)間為90 min和，料液比為1:40，提取3次，在此優(yōu)化條件下，沙棘果渣總黃酮含量為3.157%。

通過(guò)自由基清除率測(cè)定實(shí)驗(yàn)，表明沙棘果渣黃酮類化合物對(duì)生物體內(nèi)常見(jiàn)的2 種氧自由基都具有一定的清除作用，隨著黃酮質(zhì)量濃度的增大，對(duì)自由基的清除能力也增強(qiáng)。研究結(jié)果還表明其對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用強(qiáng)于對(duì)羥自由基的清除作用，這和已有的研究結(jié)果基本一致[9]。因此，甘肅天水地區(qū)沙棘果渣在抗氧化劑和功能食品的開發(fā)方面有良好的應(yīng)用前景，這將為利用沙棘進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)黃酮類化合物提供理論依據(jù)。