王 濤，劉宏祥，王 穎，王 楊，劉 一，閆麗靜

(河北大學附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科， 保定 071000)

腦卒中屬于臨床常見腦血管疾病，其發(fā)病率、致死率逐年升高，而腦卒中患者中約50%死因為肺損傷[1]。目前關(guān)于腦卒中引發(fā)肺損傷機制研究較多，但尚未有統(tǒng)一定論。研究顯示炎癥反應在腦缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮重要作用，其中Akt屬于磷脂酰肌醇激酶-3(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信號通路中重要蛋白，其激活后能夠抑制炎癥反應，保護腦損傷、肺損傷[2]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)在受到炎癥因子刺激后可轉(zhuǎn)移至細胞核促進炎癥相關(guān)基因的表達[3]。核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)被認為是腦缺血后最先啟動的炎癥因子，抑制其表達后能夠減輕腦缺血引發(fā)肺損傷[4]。Akt、JNK3、NF-κB是否也參與腦缺血引發(fā)的肺損傷，目前研究不多。清熱化痰解毒方要由郁金、蒲公英、丹參、杏仁、黃芩等組成，具有清熱解毒效果、活血透表祛風、化痰止咳的功效，在肺部病變中應用較多。臨床研究顯示直腸滴注清熱化痰方可治療腦病并發(fā)肺部感染，且效果較好[5]。清熱解毒中藥治療肺損傷患者后能夠明顯減輕肺組織病變，降低肺組織中炎癥指標水平[6]。痰熱清干預肺損傷大鼠后可降低肺組織中MDA水平，升高SOD水平，改善肺組織病理保護肺部功能[7]。本研究通過制備腦缺血再灌注-肺損傷大鼠，并給予清熱化痰解毒方，以探究腦卒中相關(guān)性肺炎肺損傷的發(fā)病機制，為臨床研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠144只，體重為220～260 g，6月齡，購自河南省實驗動物中心 [SYXK(豫)2016-0002]，[SCXK(豫)2016-0009]。嚴格遵循動物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境統(tǒng)一設(shè)定為溫度為25℃，濕度為60%，飲用蒸餾水，喂養(yǎng)期間保持房間干凈、通風，并定時清理鼠籠。本研究經(jīng)河南省動物倫理委員會批準同意，審查編號：20160816。

1.2 主要試劑和儀器

藥品與試劑：清熱化痰解毒方(成分主要包括瓜蔞10 g、郁金10 g、石菖蒲10 g、蒲公英10 g、丹參10 g、桔梗10 g、杏仁10 g、射干10 g、川貝10 g、黃芩10 g，藥材均購自于張仲景大藥房)；尼莫地平(亞寶藥業(yè)集團股份有限公司；批號：20160817；規(guī)格：20 mg)； p-Akt、p-JNK3、Caspase-3兔抗鼠單抗購自于英國Abcam生物公司；p65、p50、β-actin兔抗鼠單抗購自于美國SantaCruz公司；山羊抗兔IgG二抗購自于上海容創(chuàng)生物科技有限公司；蘇木素、伊紅染液購自于美國Sigma公司；BCA試劑盒購自于Thermo Fisher Scientific公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自于北京天根生化科技有限公司；儀器：全自動生化檢測儀購自于BECKMAN公司；SOD、MDA酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自于Biovision公司；SMZ745尼康光學顯微鏡購于上海衡浩儀器有限公司；CFX96 PCR儀購自于美國BioRad公司；GIS-500凝膠成像儀購自于Miulab公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 腦缺血再灌注-肺損傷大鼠模型的建立

按參照文獻[8]制備腦缺血再灌注大鼠，腹腔注射3 mg/g 20%水合氯醛進行麻醉，固定，消毒，分離頸總、內(nèi)外動脈，用棉線于總動脈處環(huán)向繞1 cm，兩側(cè)線環(huán)交叉埋于皮下并縫合切口。隨后轉(zhuǎn)移大鼠至立體定位儀暴露頸椎后將注射器插入頸椎橫突翼小孔內(nèi)，輕柔旋轉(zhuǎn)，當有血液流出時，說明椎動脈穿刺成功。24 h后打開頸部切口，采用顯微鏡動脈夾將雙側(cè)勁動脈夾住后阻斷腦部供血，15 min后撤去動脈夾恢復腦部供血。造模后符合以下的大鼠確定為肺部感染：(1)精神萎靡、毛發(fā)光澤度差、進食量減少、飲水增多、體重降低、耳緣靜脈突起加粗、鼻唇分泌液增多；(2)呼吸急促，肺部出現(xiàn)啰音。

1.3.2 動物分組以及給藥方法

所有大鼠按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組(僅暴露頸總動脈，不阻斷血管)、模型組、清熱化痰解毒方低、中、高劑量預處理組、陽性組(尼莫地平組)，每組24只。(1)假手術(shù)組、模型組大鼠均灌胃等量生理鹽水；(2)清熱化痰解毒方低、中、高劑量藥物劑量為7、14、28 mg/kg；(3)陽性組給藥劑量為200 mg/kg尼莫地平。各組給藥時間為預處理大鼠在造模前3日灌胃，每日2次，最后一次給藥時間為造模前3 h，共給藥7次。給藥劑量參照人體表法[9]計算，成年人標準體重60 kg，大鼠給藥劑量為成人的6.25倍，成人每日給藥劑量為60 mg，所有大鼠平均體重220 g，則大鼠每日給藥劑量為7 mg/kg。

1.3.3 動脈氧分壓的測定

于大鼠右側(cè)股動脈采集2 mL血液，采用全自動生化檢測儀對動脈血氧分壓(Partial pressure of oxygen，PaO2)進行測定，并計算氧合指數(shù)(oxygenation index， OI)。

1.3.4 大鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage，BAL)中中性粒細胞(Polymorphonuclear neutrophil leukocyte，PMN)計數(shù)

各組選取12只大鼠進行支氣管肺泡灌洗，利用自動血細胞分析儀對BAL中PMN進行計數(shù)。

1.3.5 大鼠肺組織濕干重變化

各組隨機選取12只大鼠處死后，將右肺下葉用濾紙吸干水后置于玻璃試管中稱重，所測重量為濕重，隨后放置在干燥箱中，溫度設(shè)為80℃，連續(xù)烘烤直至質(zhì)量測定不變時此時重量為干重，計算大鼠肺組織W/D。

1.3.6 肺組織SOD、MDA以炎癥因子檢測

用無菌剪刀將肺組織剪碎，制作10%勻漿液，放置低溫離心機中4000 r/min離心10 min，收集上清，采用酶聯(lián)免疫法測定組織中SOD、MDA、TNF-α、IL-1β活性，具體參照試劑盒說明進行操作。

1.3.7 Western blot檢測肺組織中Akt/JNK3/Caspase-3和NF-κB蛋白表達

肺組織剪碎后添加蛋白裂解液放置30 min，離心后收集上清液，參照蛋白提取試劑盒提取肺組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜反應，置于凝膠成像儀中觀察Akt、p-Akt、JNK3、p-JNK3、Caspase-3、p65、p50蛋白表達情況。

1.3.8 免疫組化法檢測肺組織中p-Akt、p-JNK3、p65、p50蛋白陽性表達

常規(guī)制備肺組織石蠟切片，免疫組組化法檢測肺組織中p-Akt、p-JNK3、p65、p50蛋白，置于顯微鏡下進行觀察統(tǒng)計陽性染色細胞數(shù)，計算陽性百分比=陽性數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般癥狀觀察

大鼠在模型制備過程中，未出現(xiàn)死亡，造模成功大鼠共96只。假手術(shù)組大鼠精神狀態(tài)較好，毛發(fā)光澤，飲水、攝食正常，體重逐漸增加，耳唇分泌液正常，呼吸正常。模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)光澤度差、進食量減少、飲水增多、體重降低、耳緣靜脈突起加粗、鼻唇分泌液增多，呼吸急促，肺部出現(xiàn)啰音。經(jīng)清熱化痰解毒方治療后，得到不同程度改善。

2.2 各組大鼠動脈氧分壓以及PMN測定結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組肺組織干濕重比值、中性粒細胞數(shù)升高，動脈氧分壓、氧合指數(shù)均降低，差異有顯著性(P< 0.05)；與模型組相比，陽性組、清熱化痰解毒方組W/D、PMN降低，PaO2、OI、PMN升高，具有劑量依賴性，差異有顯著性(P< 0.05)。

2.3 肺組織光鏡檢測結(jié)果

假手術(shù)組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，未出現(xiàn)炎性細胞浸潤；與假手術(shù)組相比，模型組肺組織毛細血管擴張，彌漫性充血，出現(xiàn)炎性浸潤，肺泡腔內(nèi)有紅細胞滲出以及炎性浸潤，肺泡壁增厚、充血；陽性組、燈盞花素治療組大鼠肺泡腔結(jié)構(gòu)逐漸恢復、炎性細胞浸潤減輕。見下圖1。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肺組織病理評分升高，差異有顯著性(P< 0.05)；與模型組相比，陽性組、清熱化痰解毒方組大鼠肺組織病理評分均降低，隨著給藥劑量的升高，肺組織病理評分逐漸降低，差異有顯著性(P< 0.05)。給藥后，假手術(shù)組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性組大鼠肺組織病理學評分分別為0、(3.78±0.74)、(2.87±0.52)、(2.28±0.71)、(0.97±0.28)和(0.64±0.17)分，各組組間比較差異有顯著性(P< 0.05)。

2.4 各組SOD、MDA水平測定結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組SOD降低，MDA、TNF-α、IL-1β升高，差異有顯著性(P< 0.05)；與模型組相比，陽性組、清熱化痰解毒方組SOD升高，MDA、TNF-α、IL-1β降低，具有劑量依賴性，差異有顯著性(P< 0.05)。見下表2。

表1 各組大鼠W/D、PaO2、OI水平對比

注：與假手術(shù)組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05；與低劑量組相比，aP< 0.05；與中劑量組相比，bP< 0.05。Note. Compared with the sham group,*P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05. Compared with the low dose group,aP< 0.05. Compared with the middle dose group,bP< 0.05.

圖1 肺組織病理形態(tài)學(HE染色，×400)

表2 各組大鼠SOD、MDA水平對比

Table 2 Comparison of SOD and MDA levels in rats in each group

組別 GroupsSOD(NU/mg)MDA(umol/g) TNF-α(pg/mL) IL-1β(pg/mL) 假手術(shù)組 Sham group模型組 Model group低劑量組Low dose group中劑量組Middle dose group高劑量組High dose group陽性組Positive group36.69±2.0722.63±1.29*25.76±1.03#28.56±1.19#a34.18±1.55#ab33.29±1.14#134.27±13.66203.75±16.38*184.69±16.44#167.33±15.85#a155.49±15.79#ab145.63±15.49#16.57±4.22257.56±20.64*200.18±23.44#170.23±19.25#a141.69±15.53#ab105.76±14.28#6.04±1.06193.54±28.46*134.25±20.34#113.49±15.48#a91.39±10.65#ab82.45±11.39#

注：與假手術(shù)組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05；與低劑量組相比，aP< 0.05；與中劑量組相比，bP< 0.05。Note. Compared with the sham group, *P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05. Compared with the low dose group,aP< 0.05. Compared with the middle dose group,bP< 0.05.

2.5 Western blot檢測肺組織中Akt、p-Akt、JNK3、p-JNK3、Caspase-3、p65、p50蛋白表達

與假手術(shù)組相比，模型組p-JNK3、Caspase-3、p65、p50蛋白表達升高，p-Akt蛋白表達降低，差異有顯著性(P< 0.05)；與模型組相比，陽性組、清熱化痰解毒方組p-Akt、p-JNK3、Caspase-3、p65、p50蛋白表達降低，p-Akt蛋白表達升高，具有劑量依賴性，差異有顯著性(P< 0.05)。各組Akt、JNK3蛋白表達無明顯變化(P> 0.05)。見表3,圖2。

2.6 免疫組化檢測肺組織中p-Akt、p-JNK3、p65、p50表達

與假手術(shù)組相比，模型組p-JNK3、p65、p50蛋白陽性表達率升高，p-Akt蛋白陽性表達率降低，差異有顯著性(P< 0.05)；與模型組相比，陽性組、清熱化痰解毒方組p-JNK3、p65、p50陽性表達率降低，p-Akt蛋白陽性表達率升高，具有劑量依賴性，差異有顯著性(P< 0.05)。見表4。

注：A：假手術(shù)組;B：模型組；C：低劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組；F：陽性組。

表3 大鼠肺組織中Akt、p-Akt、JNK3、p-JNK3、Caspase-3、p65、p50蛋白表達

Table 3 Expression of Akt, p-Akt, JNK3, p-JNK3, Caspase-3, p65, and p50 proteins in rat lung tissue

組別 GroupsAktp-AktJNK3p-JNK3Caspase-3p65p50假手術(shù)組 Sham group0.72±0.130.76±0.040.58±0.120.17±0.030.22±0.041.29±0.061.16±0.05模型組 Model group0.69±0.16*0.13±0.08*0.64±0.11*0.95±0.09*0.83±0.08*0.22±0.03*0.18±0.05*低劑量組Low dose group0.62±0.14#0.24±0.09#0.66±0.11#0.78±0.09#0.68±0.13#0.49±0.03#0.33±0.08#中劑量組Middle dose group0.67±0.12#a0.42±0.06#a0.63±0.14#a0.64±0.13#a0.52±0.06#a0.71±0.11#a0.76±0.06#a高劑量組High dose group0.70±0.16#ab0.58±0.13#ab0.61±0.13#ab0.48±0.08#ab0.38±0.09#ab0.97±0.09#ab0.92±0.07#ab陽性組Positive group0.60±0.18#0.63±0.05#0.56±0.12#0.21±0.03#0.26±0.05#1.11±0.08#1.05±0.06#

注：與正常組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05；與低劑量組相比，aP< 0.05；與中劑量組相比，bP< 0.05。Note. Compared with the sham group,*P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05. Compared with the low dose group,aP< 0.05. Compared with the middle dose group,bP< 0.05.

表4 肺組織中p-Akt、p-JNK3、p65、p50蛋白陽性表達

注：與正常組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05；與低劑量組相比，aP< 0.05；與中劑量組相比，bP< 0.05。Note. Compared with the sham group, *P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05. Compared with the low dose group,aP< 0.05. Compared with the middle dose group,bP< 0.05.

3 討論

過往研究認為腦缺血早期容易導致肺損傷，且肺組織會出現(xiàn)典型病理特征，主要為肺泡結(jié)構(gòu)變化、肺水腫、以及炎性浸潤[10]。本研究采取腦中動脈線栓法制備腦缺血再灌注大鼠模型，結(jié)果顯示模型組大鼠肺組織出現(xiàn)腫脹伴彌漫性肺出血，毛細血管擴張，彌漫性充血，出現(xiàn)炎性浸潤，符合肺損傷特點[11-12]。進一步研究顯示模型組W/D、PMN、TNF-α、IL-1β升高，PaO2、OI均降低，表明肺組織出現(xiàn)缺氧、炎癥細胞浸潤、氧化應激損傷，以上均提示腦缺血再灌注損傷大鼠肺損傷模型制備成功。在給予清熱化痰解毒方后，大鼠肺組織炎癥損傷有一定改善，W/D、MDA、TNF-α、IL-1β降低，PaO2、OI、SOD升高，提示清熱化痰解毒方能夠緩解肺部炎癥損傷，降低氧化應激反應進而保護肺功能。

近期越來越多研究表明PI3K/AKT信號通路與肺損傷密切有關(guān)[13-15]。本研究結(jié)果顯示模型組p-Akt蛋白表達降低，給予清熱化痰解毒方后p-Akt蛋白表達升高，說明清熱化痰解毒方緩解卒中大鼠肺部炎癥損傷可能與激活Akt蛋白有關(guān)。JNK信號通路激活后使JNK蛋白中Thr位點發(fā)生磷酸化進而激活JNK，隨后JNK進入細胞核內(nèi)，發(fā)揮其生物學效應[16]。胰腺炎肺損傷大鼠發(fā)病初期p-JNK表達明顯升高，且經(jīng)干預后其表達明顯降低，表明JNK蛋白參與胰腺炎肺損傷病理過程[17]。高氧肺損傷大鼠JNK信號通路激活可導致肺組織細胞大量凋亡，引發(fā)肺損傷[18]。本研究結(jié)果顯示模型組p-JNK3蛋白表達降低，清熱化痰解毒方組p-JNK3蛋白表達升高，提示清熱化痰解毒方緩解卒中大鼠肺部炎癥損傷可能與激活JNK3蛋白有關(guān)。

Caspases為細胞凋亡主要調(diào)節(jié)者，其能夠激活DNA斷裂因子引發(fā)細胞死亡，抑制Caspase-3表達可降低組織細胞凋亡，降低組織損傷[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，清熱化痰解毒方干預可使Caspase-3表達下降，提示清熱化痰解毒方能夠抑制Caspase-3表達進而減輕肺炎癥損傷。NF-κB在機體內(nèi)主要以二聚體形式存在，細胞未受到外界刺激時，NF-κB與抑制物IKBa結(jié)合，細胞受到刺激后，IKBa發(fā)生磷酸化后，使NF-κB轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，促進靶基因的轉(zhuǎn)錄[20-21]。本研究結(jié)果顯示模型組肺組織中p65、p50蛋白表達明顯升高，而給予清熱化痰解毒方后能夠明顯降低p65、p50蛋白表達，提示清熱化痰解毒方可能通過抑制NF-κB通路改善大鼠肺部炎癥損傷。

綜上所述，本研究成功制備卒中相關(guān)性肺炎大鼠模型，發(fā)現(xiàn)JNK3/Caspase-3和NF-κB信號通路激活，Akt通路被抑制；給予清熱化痰解毒方發(fā)現(xiàn)其能夠緩解卒中相關(guān)性肺炎大鼠肺炎癥損傷，其機制可能與抑制JNK3/Caspase-3和NF-κB信號通路、激活Akt有關(guān)。然而本研究未能直接證實清熱化痰解毒方緩解腦缺血再灌注肺損傷直接作用于肺，這還有待后續(xù)深入探究。