袁松華，傅衛(wèi)輝，何涌泉，徐建青,2，張曉燕,2*

(1.復旦大學附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508； 2.復旦大學生物醫(yī)學研究院，上海 200032)

美國疾病預防控制中心發(fā)布的關于1976—2007年度全美流感病例報告顯示，每年65周歲及以上的老年人群中每10萬人的發(fā)病人數約為321.1，而18～64周歲的成年人群里每10萬人的發(fā)病人數僅為39.9[1]。更為嚴重的是，因流感及流感樣癥狀死亡的數量每年超過3.6萬，其中89.1%是65周歲及以上老年感染者[2]。由此可見，老年人群是流感病毒感染風險系數最高的年齡組群。與年輕人群相比，老年感染者的癥狀更加嚴重，誘發(fā)慢性肺阻塞性疾病，充血性心力衰竭，哮喘以及心肌梗塞等慢性合并癥[3]。即使體內流感病毒已經清除，一些重癥的老年感染者會部分甚至全部喪失自主的日常生活能力[4-5]。因此，流感病毒感染老年人群引發(fā)的經濟學和社會學問題，已經成為威脅公共衛(wèi)生安全的重要挑戰(zhàn)。

在流感病毒感染的極早期，老年感染者對體溫升高重視不夠，因流感樣癥狀收治入院時間相對滯后。另外，重癥流感的老年病患臨床特點主要為，病程進展速度快，感染后易出現多種并發(fā)癥，感染后致死率較高[6]。研究標本采集主要集中于外周血和咽拭子等。但肺內原位炎癥、病理變化以及淋巴歸巢應答研究等更深層次的機制研究，受標本取材、倫理等因素制約難以收集。此外，已經獲批的特異性針對老年人群的有效流感抗病毒藥物、流感疫苗的種類較少，現有抗病毒藥物[7]或三價滅活疫苗的保護效果有限[8]，一個科學的用于藥物或疫苗有效性評估的動物模型是必需的。以上各種現實挑戰(zhàn)亟待一個穩(wěn)定可靠，同時具備一定擬合度的動物模型，用于研究老年流感病毒感染免疫應答。近交系小鼠模型是免疫學研究重要工具，遺憾的是，現有的研究關于老齡近交系小鼠流感感染免疫模型的報道并不明確。因此本課題組以流感病毒H9N2為模式病原，分別從體重變化、生存曲線、肺內病毒復制、肺內炎癥因子表達以及肺的病理損傷情況等幾個方面進行全面闡述，建立老年近交系C57小鼠的感染免疫模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗小鼠均選用SPF級別雌性C57小鼠，6～8周齡(18～19 g)和8月齡(22～24 g)各30只，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[SCXK(滬)2013-0016]。8月齡小鼠在上海市公共衛(wèi)生臨床中心實驗動物部SPF區(qū)域[SYXK(滬)2015-0008]繼續(xù)飼養(yǎng)至18～24月齡(28～30 g)。

1.2 流感病毒

H7N9、H9N2病毒經MDCK細胞和雞胚培養(yǎng)滴定后，-80℃儲存?zhèn)溆?。實驗均在動物生物安全三級實驗?ABSL-3)中進行。[高致病性病原微生物實驗室資格證書編號為衛(wèi)BSL3-007；中國合格評定國家認可委員會實驗室認可證書編號NO.CNAS BL0016]，研究方法經過上海市公共衛(wèi)生臨床中心動物倫理委員會審查(編號為：2014倫審K007號)。

1.3 實驗方法

1.3.1 老年小鼠流感病毒感染模型

受試小鼠提前24 h轉入生物安全實驗室適應，分為老年感染組、成年感染組、老年未感染對照組以及成年未感染對照組共計4大組，每組小鼠10只。小鼠腹腔注射100 μL 1%戊巴比妥鈉溶液全身麻醉，5×106EID50H9N2或3.5×105TCID50H7N9流感病毒經鼻腔攻擊，記錄各組小鼠感染后連續(xù)14 d的體重變化、生存情況。

1.3.2 石蠟切片蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE) 染色

將肺組織在10%的福爾馬林溶液，靜置固定24 h，包埋于石蠟中。蠟塊制備為10 μm切片(白片)數張備用。60℃烤片1 h，依此在二甲苯，無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇依次浸泡脫蠟3～5 min，PBS洗滌，蘇木精染色5 min，自來水洗去蘇木精染液，0.5%伊紅染液染色1 min，自來水洗脫，85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯依次脫水3 min，晾干，封片。切片由奧地利Tissue Gnostics類流式組織定量細胞分析儀拍攝分析。

1.3.3 炎癥-趨化因子檢測

收集感染急性期內(第1、2、3、7天)小鼠肺內灌洗液和外周血，肺灌洗液4℃，12 000 r/min離心5 min，分裝上清，將外周血混入抗凝劑(3.8%枸椽酸鈉溶液與全血1∶9混合)重復混勻，3000 r/min離心10 min，分裝上清。分別取50 μL肺灌洗液、血漿和梯度稀釋后標準品，依次加入50 μL預混多因子磁珠，50 μL PE標記的熒光染色溶液，室溫避光孵育2 h。200 r/min離心5 min，用試劑盒內專用的洗滌緩沖液洗1次，最后每管標本終體積為100 μL。全部標本由美國BD公司的LSR Fortessa多色流式細胞儀分析獲取數據。

注：圖中黑色實線表示老年小鼠感染H7N9或H9N2流感病毒或者未感染后體重變化，圖中虛線表示同等流感病毒感染條件下，成年對照小鼠體重變化。計算依據：體重變化=(時間點體重-初始體重)/初始體重×100%。

1.3.4 肺內流感病毒載量測定

分別在感染急性期內(第1、2、3、7天)小鼠肺組織，含10%FBS的1640培養(yǎng)液洗滌2次，每只小鼠取2 g組織，加入1 mL Trizol裂解液、直徑1 mm小鋼珠2粒，60 Hz超聲破碎60 s，超聲2次，組織懸液12 000 r/min 離心5 min，收集上清后，混入等體積的去離子水，劇烈振蕩15 s，室溫靜置10 min。12 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入500 mL異丙醇，室溫靜置10 min，12 000 r/min離心5 min，再次棄上清，500 mL75%乙醇洗滌1次，2000 r/min離心5 min，再次棄上清，RNA沉淀溶于100 μL的無RNA酶的去離子水中。RNA定量后，取1 μg RNA逆轉錄為cDNA后，使用SYBR試劑進行Real-time PCR擴增H9N2、GAPDH的序列。全部樣品由德國Eppendorf公司的Realplex 4熒光定量PCR儀分析獲取數據。擴增程序：42℃，10 min；95℃，1 min；95℃，15 s；60℃，45 s；45個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 與H7N9病毒相比，H9N2病毒感染老年小鼠體重變化和生存變化

在未感染的條件，兩組小鼠體重波動在14 d內不超過5%(圖1)，作為環(huán)境對照可以確保研究環(huán)境是穩(wěn)定安全的，影響小鼠的體重變化的單一因素是流感病毒的感染。感染H7N9流感病毒的老年小鼠體重下降速率快(圖1)，感染后第7天體重下降超過30%(成年對照22%，兩組曲線無顯著性差異)，另一組老年小鼠感染H9N2流感病毒后前7天內迅速下降至25%左右，組內成年對照體重下降不超過10%，具有顯著性差異(圖1)。

進一步分析生存情況，感染H7N9的老年小鼠第5天死亡50%，第11天全部死亡(圖2)，而成年對照第8天死亡50%，第14天死亡在90%，兩組小鼠的死亡速率和程度相近。H9N2感染模型生存終點顯示，老年小鼠在感染死亡50%，成年對照無死亡(圖2)。對比老年小鼠在H7N9和H9N2流感病毒感染過程中體重變化和生存情況，最終認定老年小鼠感染H9N2的流感感染模型更擬合臨床感染實際情況。

2.2 感染H9N2流感的老年小鼠肺內病毒復制失控，肺內炎癥表達變化

感染H9N2流感病毒后，老年小鼠肺內病毒復制在第2天達到峰值(每克肺內RNA病毒拷貝為3.2×104)(圖3)，第3天至第7天，肺內的流感病毒逐漸清除。在感染后第1、2、3和7天四個時間點，老年小鼠肺的病毒復制情況均顯著高于成年對照(P< 0.001)。與成年對照相比，老年小鼠肺內流感病毒復制控制能力更弱。

注：圖中黑色實線表示老年小鼠感染H7N9或H9N2流感病毒后生存情況，虛線代表同等感染條件下成年小鼠對照。

注：圖中四組bar依次代表小鼠感染H9N2病毒后第1、2、3和7天共計4個時間點肺內流感病毒相對載量拷貝。與成年對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01,***P< 0.001。

在感染后第1、2、3和7天四個時間點，收集100 μL肺泡灌洗液，檢測具代表性的6類炎癥-趨化因子。結果發(fā)現老年小鼠肺內炎癥因子IL-6、趨化因子MCP-1急劇升高，在感染后第2天達到峰值，均超過4000 pg/mL，第3天至第7天炎癥因子表達逐漸下降(圖4a)。成年對照肺內炎癥表達相對適度，峰值均未超過1000 pg/mL，感染后第3天迅速恢復至基線水平(圖4b)。將峰值點的炎癥-趨化因子分類分析發(fā)現，老年小鼠肺內炎癥主要以炎癥因子IL-6和趨化因子MCP-1為主(圖4c)，而成年小鼠肺內炎癥因子包括炎癥因子TNF-α、IL-6以及負調控因子IL-10(圖4d)。

2.3 感染H9N2流感的老年小鼠肺內損傷情況和修復時間

在未感染的條件下，相比與成年對照，老年小鼠的肺泡增大，致密性更低。感染H9N2病毒第1天，老年小鼠肺內出現大量的炎性細胞，肺泡壁開始增厚，肺泡結構少量出現破損，在第2、3天，肺泡結構嚴重破環(huán)，大量紅細胞滲入肺間隙，大量肺泡壁增厚。感染后第7天，肺泡結構部分修復，尚有大量的炎性細胞和少量的紅細胞滯留在肺間隙內。感染H9N2病毒后，成年小鼠肺內出現適量的炎癥細胞侵潤，但肺泡結果相對完整。感染后第7天，肺泡結構修復良好，肺內炎性細胞很少潴留或幾乎沒有(圖5a)。

根據文獻中的評分體系(表1)[9]，對兩組小鼠的肺內動態(tài)病理損傷情況進行定量分析。統(tǒng)計結果提示老年小鼠感染H9N2病毒后第1、2、3和7天，肺組織損傷評分均顯著高于成年對照(圖5b)。感染后第7天，老年小鼠肺內損傷沒有完全修復，成年小鼠肺內損傷修復良好。

注：圖a、b依次代表小鼠感染H9N2病毒后第1、2、3和7天共計4個時間點肺內灌洗液中多個炎癥-趨化因子動態(tài)變化。圖c、d代表感染后第2天(炎癥表達峰值時間點)肺內炎癥-趨化因子的組成比例。左側圖a、c為老年小鼠，右側圖b、d為成年對照，分別檢測了第0，1，2，3，7天5個時間點。

表1 肺組織病理檢查評分系統(tǒng)

Table 1 Scoring system for histopathological examination of lung tissue

參數Parameter描述Interpretation打分Score肺泡細胞數量Inflammation無No inflammatory cells in alveolar00～5個細胞0-5 cells in alveolar15～10個細胞5-10 cells in alveolar2>10個細胞>10 cells in alveolar3肺泡壁水腫程度Edema無Absent0肺泡壁增厚Increased swelling of alveolar walls1肺泡壁增厚:纖維蛋白滲出Increased swelling of alveolar walls and fibrinous2大量肺泡壁增厚:纖維蛋白滲出Widespread swelling of alveolar walls and fibrinous3紅細胞滲出數量Hemorrhage<5個紅細胞<5 erythrocytes in alveolar05～10個紅細胞5-10 erythrocytes in alveolar110～15個紅細胞10-15 erythrocytes in alveolar2>15個紅細胞>15 erythrocytes in alveolar3肺泡破損程度Atelectasis無Absent0小面積肺不張Small atelectasis areas involved1大面積肺不張:形成1～5小葉Large atelectasis areas and some lobules involved2形成>5個小葉Several lobules involved3

注：上行顯示的是老年小鼠在感染H9N2后第0、1、2、3和7天共計5個時間點的肺組織HE染色結果，下行顯示的是成年小鼠在H9N2感染過程中對應時間點的肺HE染色結果。

注：根據美國胸科醫(yī)師協(xié)會官方雜志Chest中關于急性肺損傷模型報道，擬定肺病理損傷的評判標準分為肺泡內外炎性細胞數量，肺泡壁水腫程度，紅細胞滲出數量以及肺泡破損嚴重程度四個方面，每一項目依據損傷的輕重程度，依次計分為0～3分。小鼠肺組織損傷最終得分四個項目得分之和，結果得分越高，代表肺損傷越嚴重。

3 討論

部分研究選用基因組DNA片段錯誤編輯產生的基因型早衰小鼠[10]或化學試劑如D-半乳糖處理產生的誘導型早衰小鼠模型[11]，這類模型小鼠的生理學特征是出生后數周內，機體表現出臟器老化、免疫衰老等的老年癥狀。這些人工促衰老模型，會出現部分共性衰老特征，然而與生理性衰老模型具有顯著的區(qū)別[12]。生理性衰老的宿主具有胸腺輸出能力不足、體液抗體分泌能力下調以及免疫細胞表面受體多樣性縮減的免疫衰老的特征[13]，如果選用人為衰老小鼠作為研究對象，不能科學地模擬老年宿主感染現狀。因此，本課題組選用的生理性衰老，月齡為國際標準的18～24月[14]，一直生活于SPF級環(huán)境的近交系C57小鼠。該模型小鼠的主要免疫學特點是體內不含特定病原體，同時免疫性質高度一致，適合免疫學群體的研究和評價。本課題組選用C57小鼠感染流感病毒，建立合適的病毒感染模型，主要評價感染后免疫應答，有助于解析老年宿主體內病理學、免疫學相關機制。

從病原學角度分析，H7N9流感病毒屬于2013年中國東部出現的新發(fā)的高致病性禽流感病毒，其中6/8的基因組片段重組來源于東亞地區(qū)家禽、水鳥類中普遍潛伏的野生型低致病性H9N2禽流感病毒[15]。H7N9[16]、H9N2[17]病毒的攻毒劑量標準均參照前期成年小鼠感染模型中等同劑量。高致病性H7N9流感病毒感染后，兩組不同月齡的小鼠體重下降速率和死亡情況的差異較小，與臨床感染情況不符合。本課題組嘗試梯度稀釋10倍，發(fā)現老年小鼠感染后，第7天開始出現死亡，第14天組內小鼠全部死亡，體重下降速率和生存曲線類似，病理癥狀出現由感染后第1天，調整至第7天(數據未顯示)。老年小鼠感染H9N2流感病毒后7天內，體重下降20%以上，死亡達到50%，與6～8周成年C57小鼠有顯著區(qū)別。因此，本課題組認為H9N2流感病毒更適合老年小鼠流感病毒感染模型的病原。

2013年收治入院的H7N9流感病毒感染者臨床研究發(fā)現，65周歲以上的老年人占比為72.2%(13/18)，死亡率為22.2%(4/18)，均高于成年人的住院率27.8%和死亡率11.1%[18]。年齡和恢復時間進行線性回歸統(tǒng)計，結果顯示隨著年齡越大，感染恢復(住院天數)時間越長，呈顯著正相關回歸關系(P=0.0194)。另外在感染者血漿炎癥動態(tài)學分析發(fā)現[19]，老年感染者外周血中炎癥因子IL-6(> 80 pg/mL)，趨化因子IL-8(> 60 pg/mL)的分泌水平顯著高于成年對照(P=0.003，P=0.03)，絕對數值超過基線水平的10倍以上。肺組織病理切片同時清晰提示了H7N9老年感染者肺泡細胞壁增厚，肺泡間隙進一步被壓縮，更多的炎性淋巴細胞趨化至病灶，肺損傷程度甚于成年。從模型可以看出老年小鼠組的體重下降速率、生存率，前7天肺內病毒控制情況，肺灌洗液中炎癥因子的表達均顯著高于成年對照，更符合臨床實際情況。

重癥流感的老年感染者臨床突出表現為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難以及上呼吸感染等，早期診斷主要評價呼吸頻率、心率增快，谷丙轉氨酶、膽紅素為指標的肝功能異常，血小板計數降低等常規(guī)生化指標。但是由于老年感染者的臨床表現與炎癥指標相對不特異，現有臨床指標正常值范圍均基于健康成年人群界定的。本課題組通過18～24月齡的老年C57小鼠H9N2流感病毒感染模型，在感染期重現了老年宿主發(fā)病率、死亡率更高的臨床現象。在急性感染期，發(fā)現老年宿主肺清除流感病毒的能力更弱，肺內炎癥因子IL-6、趨化因子MCP-1更高水平，感染后肺組織損傷程度更為嚴重。因此，本課題組成功建立老年小鼠感染免疫模型，以肺內炎癥因子IL-6和趨化因子MCP-1為特異性早期免疫指標評估老年宿主感染病毒后肺內病毒清除情況以及肺臟損傷與修復情況。