杜興蘭，周建波，冉隆賢

(1.河北省塞罕壩機(jī)械林場總場， 河北圍場 068466； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院， 河北保定 071001)

葡萄白粉病是由葡萄白粉菌[Uncinulanecator(Schw.) Burr.]引起的一種真菌病害，幾乎遍布世界所有葡萄產(chǎn)區(qū)，嚴(yán)重影響葡萄生產(chǎn)[1-4]。生產(chǎn)上防治白粉病主要以化學(xué)農(nóng)藥為主，造成環(huán)境污染和果實(shí)殘留，使葡萄品質(zhì)下降，制約了葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5-6]。因此，有必要尋找一種高效、無污染的防治方法。

生物防治以其高效、低毒、低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)逐漸受到重視[7-8]。在國內(nèi)外，已有對黃瓜白粉病、小麥白粉病和葫蘆白粉病等生物防治方面的研究[9-10]，但截至目前，對葡萄白粉病的生物防治方面的研究尚未見報(bào)道。因此，篩選對葡萄白粉病防治較理想的生防菌株，具有十分重要的意義。筆者選用鏈霉菌、熒光假單胞桿菌和惡臭假單胞桿菌及其轉(zhuǎn)基因菌株，開展了葡萄白粉病生物防治的研究，旨在為開發(fā)葡萄白粉病的生防制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。鏈霉菌菌株：龜裂鏈霉菌(Streptomycesrimosus)、金色鏈霉菌(Streptomycesaureofaciens)、CN120(Streptomycessp.)和CN121(Streptomycessp.)。細(xì)菌菌株：惡臭假單胞桿菌WCS358r及其嗜鐵素缺失實(shí)變體JM218，轉(zhuǎn)基因菌株WCS358::phl、WCS358::phz和熒光假單胞桿菌CHA0r。WCS358::phl和WCS358::phz是通過遺傳工程的方法分別將產(chǎn)生2.4-二乙酰間苯三酚(2，4-diacetylphloroglucinol,DAPG)和吩嗪-1-羧酸的基因轉(zhuǎn)入到WCS358r的基因組中獲得轉(zhuǎn)基因菌株[11-13]。

熒光假單胞桿菌P.fluorescensWCS417分離自小麥根際土壤[14-15]。以該菌抗利福平的突變體WCS417r作為親本菌株，將產(chǎn)生2，4-二乙酰間苯三酚(DAPG)的基因phl[16]插入到WCS417r的染色體上，得到產(chǎn)生不同DAPG產(chǎn)量的12個菌株，分別命名為L1a12、L1b4、L1c4、L1d6、L2a12、L2b6、L2c9、L2d6、L3a12、L3b6、L3c6和L3d6。

1.1.2藥劑。20%三唑酮(triadimefon 粉銹寧)1 500倍液，山東東信生物農(nóng)藥有限公司。

1.1.3葡萄品種。葡萄品種來自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃的葡萄新品種魏可葡萄。

1.2方法

1.2.1葡萄白粉菌孢子懸浮液的配制。從新鮮感病葉片上直接刮取白粉病菌的孢子，用無菌水配成濃度為3×105個孢子/mL。

1.2.2病原菌接種方法。從室外直接采集20～25 d新鮮葉片用自來水沖洗、晾干，每葉片接種5滴配好的白粉菌菌懸液，每滴10 μL，放至25 ℃光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，光照時(shí)間為12 h/d，20 d后對照充分發(fā)病時(shí)進(jìn)行記錄。

1.2.3葡萄離體葉片防治試驗(yàn)。分別對4種鏈霉菌、10種生防菌進(jìn)行離體葉片試驗(yàn)。在上述配好的生防菌菌懸液中浸泡20 min后，取出后室溫下晾干，以無菌水為對照，每個處理重復(fù)3次[17-20]，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。

1.2.4葡萄離體葉片治療試驗(yàn)。先接種白粉病菌，在25 ℃光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)5 d后，從培養(yǎng)皿中取出葉片，在上述配好的生防菌菌懸液中浸泡5 min，取出后自然條件下晾干，并以無菌水作為對照，每個處理重復(fù)3次，放至培養(yǎng)箱中繼續(xù)保濕培養(yǎng)，20 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。

發(fā)病率=接種點(diǎn)發(fā)病數(shù)/接種點(diǎn)總數(shù)×100%

1.3數(shù)據(jù)分析 利用DPS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1鏈霉菌防治效果由圖1可知，用生防鏈霉菌對葡萄葉片浸泡20 min后，對葡萄白粉病有一定的防治作用，其浸泡生防鏈霉菌的葉片發(fā)病率均低于對照。CN120和 CN121發(fā)病率分別為73.3%和66.7%，與對照無顯著差異；金色鏈霉菌和龜裂鏈霉菌浸泡處理后防治效果最好，其發(fā)病率分別為33.3%和40.0%，與對照相比分別降低了60.0和53.3百分點(diǎn)，這兩者之間差異不顯著，但顯著優(yōu)于對照。說明用金色鏈霉菌和龜裂鏈霉菌處理過的葡萄離體葉片在實(shí)驗(yàn)室條件下能顯著提高對白粉病的抗性。

注：不同小寫字母表示不同菌株間差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercases stand for significant differences between different strains at 0.05 level圖1 鏈霉病株對葡萄白粉病的防治效果Fig.1 Control effect of Streptomyces strains on Uncinula necator

2.2WCS417r及轉(zhuǎn)phl基因菌株防治效果離體葉片在生防菌菌懸液中浸泡接種后，20 d后觀察發(fā)病情況。由圖2可知，WCS417r和 L3b6發(fā)病率分別為45%和40%，有一定的防治作用，但無顯著差異。而L1d6、L2d6和L3d6這3個菌株發(fā)病率分別為30%、25%和15%，分別比對照降低了65.0、70.0、和80.0百分點(diǎn)，顯著優(yōu)于對照，而這3個菌株之間防治效果無顯著差異。說明L1d6、L2d6和L3d6這3個菌株能提高葡萄葉片對白粉病的抗性。

注：不同小寫字母表示不同菌株間差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercases stand for significant differences between different strains at 0.05 level圖2 WCS417r及轉(zhuǎn)phl基因菌株對葡萄白粉病的防治效果Fig.2 Control effect of Pseudomonas spp.strains on Uncinula necator

2.3WCS358r及其轉(zhuǎn)基因菌株和常用藥劑防治效果由圖3可知，WCS358r、CHA0r和JM218發(fā)病率分別為53.3%、60.0%和53.3%，與對照相比發(fā)病率均降低，但與對照無顯著差異。而WCS358::phz和WCS358::phl和粉銹寧的發(fā)病率分別為40.0%、40.0%、和20.0%，分別比對照降低了53.3、53.3和73.3百分點(diǎn)，與對照相比差異顯著。

注：不同小寫字母表示不同菌株間差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercases stand for significant differences between different strains at 0.05 level圖3 WSC358r及轉(zhuǎn)基因菌株和常用藥劑對葡萄白粉病的防治效果Fig.3 Control effects of Pseudomonas spp.strains and potion on Uncinula necator

3 結(jié)論與討論

該研究通過白粉菌離體葉片試驗(yàn)，從4株鏈霉菌中選出有防治作用的龜裂鏈霉菌和金色鏈霉菌；從WCS358r及其轉(zhuǎn)基因菌株中篩選出有防治效果的WCS358::phz和WCS358::phl菌株；從WCS417r及其轉(zhuǎn)phl基因菌株共5個菌株中篩選出L1d6、L2d6和L3d6 3株有防治效果的菌株。說明WCS358r和WCS417r的轉(zhuǎn)基因菌株具有增強(qiáng)防病的效果。由于環(huán)境因素的影響，在試驗(yàn)過程中，篩選結(jié)果表現(xiàn)某些差異。因此在每次試驗(yàn)中盡量選取一致的葡萄葉片，嚴(yán)格控制溫度和濕度，使條件一致。