張洋子

摘要：多聚腺苷酸化是真核生物基因表達(dá)的重要步驟。多聚腺苷酸化位點(diǎn)（Poly（A）位點(diǎn)）標(biāo)識基因末端，準(zhǔn)確識別poly（A）位點(diǎn)有利于確定成熟的mRNA。如果一個(gè)基因含有多個(gè)poly（A）位點(diǎn)，通過不同poly（A）位點(diǎn)的選擇可以產(chǎn)生不同性質(zhì)的mRNA（Alternative Polyadenylation， APA）。全基因組3末端測序技術(shù)產(chǎn)生了大量包含poly（A）位點(diǎn)信息的序列，如何從這些序列中快速有效地獲取poly（A）位點(diǎn)成為生物學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)。本文針對3末端測序數(shù)據(jù)，通過Perl腳本和生物信息軟件的綜合利用，設(shè)計(jì)了poly（A）位點(diǎn)的全基因組提取流程，可有效提取poly（A）位點(diǎn)并對其進(jìn)行注釋，該方法優(yōu)勢是適用于多種物種，適用性廣，且運(yùn)行高效。

關(guān)鍵詞：Poly（A）位點(diǎn)；3末端測序技術(shù)；提取流程

中圖分類號：TP311 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1009-3044（2018）19-0287-01

1 研究背景和現(xiàn)狀

多聚腺苷酸化（Polyadenylation）是把一段多聚A尾巴加到mRNA上的機(jī)制，多聚腺苷酸化位點(diǎn)（Poly（A）位點(diǎn)）標(biāo)識基因末端，mRNA分子于它們的5末端進(jìn)行加帽，3端中斷，加上一段多聚A尾巴，加尾過程由多聚腺苷酸聚合酶催化進(jìn)行，進(jìn)而形成成熟的mRNA。如果一個(gè)基因含有多個(gè)poly（A）位點(diǎn)，通過不同poly（A）位點(diǎn)的選擇可以產(chǎn)生不同性質(zhì)的mRNA（Alternative Polyadenylation， APA）。APA通過改變mRNA的3UTR的長度及其性質(zhì)進(jìn)而改變位于3末端的許多潛在順式調(diào)控模式，從而達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的。

雖然當(dāng)前已獲得許多物種的poly（A）位點(diǎn)信息，但還有多種物種的poly（A）位點(diǎn)信息尚未提取，一方面Poly（A）位點(diǎn)提取的準(zhǔn)確性受測序方法和測序深度影響，另一方面poly（A）位點(diǎn)提取過程沒有流程化處理，較為煩瑣。隨著3末端測序方法的不斷探索和改進(jìn)，涌現(xiàn)出很多3末端測序方法，比如WTTS-Seq1， 3READS2，3， A-seq4， PAS-seq5。這些實(shí)驗(yàn)方法把焦點(diǎn)集中在3UTR區(qū)域，增加了獲得更多位點(diǎn)的可能性。為了幫助生物學(xué)家從海量數(shù)據(jù)中提取出有效的poly（A）位點(diǎn)，本文研究了poly（A）位點(diǎn)提取方法并整合了流程，使運(yùn)行流暢高效。

2 提取方法

Poly（A）位點(diǎn)的提取方法分為測序數(shù)據(jù)預(yù)處理、序列比對至基因組、位點(diǎn)的識別和聚類以及poly（A）位點(diǎn)的注釋4個(gè)步驟，方法流程見圖1。

1） 測序數(shù)據(jù)預(yù)處理：包括質(zhì)量控制以及去除polyA/T尾巴（測序方向決定A/T）；測序后獲得原始序列，序列3端含有連續(xù)的A/T，數(shù)據(jù)格式為FASTQ。質(zhì)量控制的目的是過濾低質(zhì)量的序列，采用FASTX-Toolkit（http：//hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit）進(jìn)行質(zhì)量控制，再去除3端接頭含有的A/T尾巴，去A/T尾過程允許一定的錯(cuò)配。

2） 序列比對至基因組。將預(yù)處理后保留的序列比對至基因組，用TMAP（（https：//github.com/iontorrent/TMAP）將序列比對至參考基因組，參考基因組可從NCBI下載，保留高質(zhì)量比對結(jié)果用于進(jìn)一步分析。

3） 位點(diǎn)的識別和聚類。識別poly（A）位點(diǎn)，根據(jù)比對后的位置以及方向信息，確定poly（A）位點(diǎn)的位置。由于poly（A）位點(diǎn)的微觀不一致性6–8，許多poly（A）位點(diǎn)之間是位置相近，已有研究表明相聚在20nt以上的poly（A）位點(diǎn)可以由不同的poly（A）信號控制，把24bp以內(nèi)的poly（A）位點(diǎn)聚類到一起，認(rèn)為是1個(gè)poly（A）位點(diǎn)。

4） Poly（A）位點(diǎn)的注釋。由于一個(gè)基因可能存在多種轉(zhuǎn)錄本或者基因有重疊，在poly（A）位點(diǎn)的注釋過程中，poly（A）位點(diǎn)可能屬于多個(gè)區(qū)域，本文采用固定位置優(yōu)先級解決這個(gè)問題。

為了檢測方法的有效性，本文從NCBI下載了8組用WTTS-Seq產(chǎn)生的小鼠的共計(jì)43，846，314條3末端測序序列，通過本文設(shè)計(jì)的poly（A）位點(diǎn)提取方法，識別出56，483個(gè)poly（A）位點(diǎn)（每個(gè)位點(diǎn)至少有16條序列支持），其中49，783個(gè)poly（A）位點(diǎn)注釋到基因內(nèi)，其他poly（A）位點(diǎn)注釋到基因間區(qū)域。約66%（8，122/12，286）個(gè)編碼蛋白質(zhì)（Protein coding）基因內(nèi)多于1個(gè)poly（A）位點(diǎn)，27% （442/1，665）個(gè)長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA， lncRNA）基因內(nèi)多于1個(gè)poly（A）位點(diǎn)。

為了進(jìn)一步檢測該方法提取出的poly（A）位點(diǎn)的可靠性，本文提取了poly（A）位點(diǎn)前100nt的堿基，分析其信號模式，根據(jù)已有的28個(gè)poly（A）信號，用滑動窗口掃描前100nt的序列，結(jié)果如圖2表示，AATAAA是最保守的信號，與現(xiàn)有研究一致。

3 結(jié)束語

本文為幫助生物學(xué)家快速提取有效的poly（A）位點(diǎn)，針對當(dāng)前3末端測序技術(shù)得到的海量數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)了poly（A）位點(diǎn)的提取方法，流程簡單，運(yùn)行效率高，適用性廣。為檢測方法的有效性，用3末端測序得到的小鼠序列進(jìn)行檢測，結(jié)果表明該方法可以提取出位于不同基因類型的poly（A）位點(diǎn)，poly（A）信號模式與當(dāng)前研究相一致。

參考文獻(xiàn)：

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