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        汞離子功能核酸生物傳感器的建立與應(yīng)用

        2018-11-01 06:07:36杜再慧李相陽田晶晶田洪濤許文濤
        分析化學(xué) 2018年6期
        關(guān)鍵詞:生物傳感器

        杜再慧 李相陽 田晶晶 田洪濤 許文濤

        摘 要 利用汞離子(Hg2+)特異性功能核酸對Hg2+識(shí)別檢測,其中模板主要包括與Hg2+特異性結(jié)合的識(shí)別區(qū)、形成G四鏈體的富G區(qū)以及由聚六乙二醇(Spacer18)鏈接的隔斷區(qū); 靶序列主要包括5'端配對區(qū)和3'端富T區(qū)。模板與靶序列只有在Hg2+存在的條件下才能結(jié)合并引發(fā)延伸,進(jìn)而使富G序列在模板上剝離下來,但由于Spacer18的隔斷作用導(dǎo)致富G序列以單鏈形式存在,在特定環(huán)境下形成具有過氧化物模擬酶活性的G-四鏈體,催化H2O2與2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)發(fā)生肉眼可見的顏色變化,進(jìn)而對Hg2+進(jìn)行定量測定。利用構(gòu)建的Hg2+功能核酸生物傳感器,35 min內(nèi)可完成檢測,線性范圍為20~500 nmol/L, 檢出限達(dá)到16.5 nmol/L (3σ)。 實(shí)際水樣中的加標(biāo)回收率為98.5%~103.5%。本方法操作簡單、成本低、耗時(shí)短,在應(yīng)急處理、實(shí)時(shí)環(huán)境檢測等方面具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

        關(guān)鍵詞 汞離子; G四鏈體; 間隔臂; 功能核酸; 生物傳感器

        1 引 言

        汞 (Hg)是一種分布廣泛的重金屬,進(jìn)入環(huán)境后很難降解,可通過生物富集作用在動(dòng)物或人體內(nèi)積累,對人體健康具有極大的危害[1~3]。生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB 5749-2006中規(guī)定Hg2+限量值為 1 mg/L[4]。建立一種廉價(jià)、快速、靈敏、特異性的Hg2+的檢測方法是非常必要的。傳統(tǒng)的Hg2+檢測方法主要包括原子吸收光譜法(AAS)[5]、原子熒光光譜法(AFS)[6]等,方法靈敏、檢出限低,但一般需要大型儀器和專業(yè)的操作人員,檢測周期長,費(fèi)用高。近年來,研究者不斷開發(fā)出特異性金屬離子功能核酸, 具有易于修飾、成本低、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[7,8],使得Hg2+功能核酸生物傳感器發(fā)展迅速[9]。

        Hg2+能與富有胸腺嘧啶(T)的脫氧核苷酸鏈特異性結(jié)合形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)[10],其結(jié)合強(qiáng)度超過正常的腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)配對。因此T-Hg2+-T錯(cuò)配可以作為一種良好的Hg2+識(shí)別元件?;赥-Hg2+-T錯(cuò)配可引起寡核苷酸鏈結(jié)構(gòu)的變化、替換以及重組的原理建立的分析方法被廣泛用于Hg2+的檢測。近年來,在Hg2+與胸腺嘧啶相互作用的基礎(chǔ)上,研究者采用電化學(xué)[11~13]、熒光[14,15]或者比色[16~18]作為信號(hào)輸出方式, 建立了許多Hg2+檢測方法。 其中,比色傳感器具有無需分析儀器、肉眼可讀、快速、容易操作等優(yōu)點(diǎn)[19],是Hg2+定點(diǎn)診斷、原位快速篩選的理想方法。最常見的比色傳感器是通過氯高鐵血紅素(Hemin)和富G序列形成的具有過氧化物模擬酶(HRP)活性的G四鏈體,可以在H2O2存在的條件下催化2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺鹽(ABTS2-)發(fā)生顏色變化。

        本研究以帶有富G和隔斷的序列為模板對Hg2+進(jìn)行特異性檢測,靶序列與模板序列同時(shí)含有6個(gè)連續(xù)T堿基的序列,不存在Hg2+時(shí),兩條序列不能結(jié)合,因此不發(fā)生延伸。當(dāng)溶液中含有Hg2+時(shí),靶序列與模板間通過T-Hg-T堿基錯(cuò)配形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu), 在DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)和脫氧核糖核苷酸(dNTPs)存在的條件下發(fā)生延伸,但由于隔斷序列的存在,富G序列只能從模板上剝離下來,以游離的單鏈形式存在。在K+、Hemin存在的條件下,形成具有過氧化物模擬酶活性的G四鏈體; 在H2O2存在的條件下,催化ABTS發(fā)生肉眼可見的顏色變化,通過顏色的變化可以對Hg2+進(jìn)行定量檢測。

        4 結(jié) 論

        利用Hg2+和胸腺嘧啶特異性結(jié)合形成T-Hg-T堿基錯(cuò)配,進(jìn)而引發(fā)延伸反應(yīng),發(fā)生鏈置換,釋放出單鏈富G序列,在K+和Hemin存在下形成具有過氧化物模擬酶活性的G-四鏈體,催化H2O2與ABTS發(fā)生肉眼可見的顏色變化,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對Hg2+的定量檢測,建立了一種Hg2+比色傳感器。此傳感器設(shè)計(jì)簡單、操作方便、檢測時(shí)間短,結(jié)果肉眼可見,具有良好的靈敏度和選擇性。檢出限達(dá)到16.5 nmol/L(3σ),可以滿足自來水樣品中Hg2+的檢測要求。

        References

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        Abstract Excessive mercury ions have negative effects on individual health. So, it is of great significance to develop a method for rapid, sensitive and specific detection of Hg2+. In this study, the method for detection of Hg2+ was developed based on specific T-Hg-T mismatche and G-quadruplex. The template sequence mainly included the recognition region which could combine with Hg2+ specifically, the rich G region which could form G-quadruplex, and the speacer 18 partition zone. The target sequence mainly included 5' ends combining area and 3' end T-rich region. Templates and targets could be combined and the elongation was triggered only in the presence of Hg2+. Furthermore, the G-rich sequences were stripped off the templates and could form a single-stranded structure, because Spacer 18 had partition function. The G-quadruplex was formed with the K+ and hemin, and catalyzed H2O2-2,2-azinobis (3-ethylbenzothiozoline)-6-sulfonic acid(ABTS) reaction with color variations. The detection could be done within 35 min, and the Hg2+ concentration exhibited a linear correlation with absorbance at 414 nm within range of 20-500 nmol/L, with a detection limit of 16.5 nmol/L (3σ). The recoveries of Hg2+ spiked in tap water were 98.5%-103.5%. The method exhibited the advantages such as simple operation, low cost and short time, and operation value in emergency treatment and real-time environmental detection.

        Keywords Mercury ion ; G-quadruplex; Spacer arm; Functional nucleic acid; Biosensor

        (Received 5 November 2017; accepted 8 March 2018)

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