陳伊 黃文焰

深圳市寶安區(qū)慢性病防治院（廣東深圳 518102）

結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌感染引起的一種慢性傳染病，目前我國(guó)結(jié)核病的患病率形勢(shì)不容樂觀并呈現(xiàn)地區(qū)不平衡性［1］。涂陰肺結(jié)核由于痰涂片陰性，在現(xiàn)有的基層診療機(jī)構(gòu)的常規(guī)結(jié)核診斷技術(shù)下，容易造成誤診漏診的情況發(fā)生，延誤患者的治療，因此如何更加準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便地診斷涂陰肺結(jié)核對(duì)于結(jié)核病的防治工作具有重要意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop?mediated isothermal amplification，LAMP）是由 NOTOMI［2］等在 2010 年創(chuàng)建，是一種新型核酸檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)最大的特點(diǎn)是不需要像傳統(tǒng)的PCR技術(shù)一樣變溫?cái)U(kuò)增，只需在恒溫條件（60～65℃）下就可完成反應(yīng)，并且結(jié)果可以目測(cè)判斷?，F(xiàn)今LAMP技術(shù)在結(jié)核病的診斷應(yīng)用方面也已有相關(guān)研究［3-9］并顯示出良好的臨床效能。2016年世界衛(wèi)生組織推薦該技術(shù)用于有肺結(jié)核臨床癥狀和體征的成人［10］。

GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)系統(tǒng)是一種以半巢式實(shí)時(shí)定量PCR為技術(shù)基礎(chǔ)的全自動(dòng)結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)系統(tǒng)，能同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥并在2 h內(nèi)完成，具有快速，準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。世界衛(wèi)生組織已批準(zhǔn)GeneXpert MTB/RIF用于結(jié)核分枝桿菌及多重耐藥結(jié)核分枝桿菌的快速診斷。國(guó)內(nèi)外也已有應(yīng)用GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)系統(tǒng)的臨床研究［11-13］。

本研究通過(guò)應(yīng)用LAMP法對(duì)臨床確診為肺結(jié)核的患者和非結(jié)核患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)，并同時(shí)與痰涂片法進(jìn)行對(duì)比分析，來(lái)評(píng)估其在肺結(jié)核尤其是涂陰肺結(jié)核中的診斷價(jià)值。傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌PCR檢測(cè)技術(shù)作為一種快速檢測(cè)技術(shù)，需要PCR實(shí)驗(yàn)室，考慮到現(xiàn)有基層結(jié)核診療機(jī)構(gòu)的設(shè)施現(xiàn)狀，以及目前同樣作為快速診斷技術(shù)的GeneXpert MTB/RIF全自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)不需要如此嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地及人員素質(zhì)要求的優(yōu)勢(shì)，本研究采用GeneXpert MTB/RIF全自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，來(lái)對(duì)比分析LAMP技術(shù)，以此評(píng)估LAMP技術(shù)在涂陰肺結(jié)核快速診斷方面的臨床價(jià)值及優(yōu)點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016～2017年本院臨床診斷為肺結(jié)核的患者170例，非結(jié)核患者100例，本次入選研究對(duì)象在16～61歲之間。

1.2 儀器與試劑 lamp法檢測(cè)試劑盒由廣州迪澳生物科技有限公司提供；GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)試劑盒由美國(guó)Cepheid公司提供；儀器：恒溫?cái)U(kuò)增儀由廣州迪澳生物科技有限公司提供；Gene Xpert儀器由美國(guó)Cepheid公司提供。

1.3 質(zhì)控菌株 結(jié)核分枝桿菌H37Rv來(lái)自深圳市慢性病防治中心，大腸埃希菌由本院提供。

1.4 方法 對(duì)入選的所有痰標(biāo)本進(jìn)行l(wèi)amp法、痰涂片抗酸染色法以及GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)。

1.4.1 LAMP技術(shù) 按照產(chǎn)品說(shuō)明書操作。每批次樣本檢測(cè)的同時(shí)行陰陽(yáng)性對(duì)照及質(zhì)控。

1.4.1.1 樣本處理 將痰樣本中加入等體積的4%NaOH溶液，渦旋振蕩混勻，室溫靜置15 min，吸取1 mL加入離心管中，12 000 r/min（離心半徑25 mm）離心5 min，去上清，加入1 m L 0.9%NaCL混勻，12 000 r/min（離心半徑25 mm）離心5 min，去上清，加入100 μL DNA提取液混勻，100℃加熱10 min后迅速冷卻，12 000 r/min（離心半徑25 mm）離心2 min，取2 μL上清液用于核酸擴(kuò)增。

1.4.1.2 加樣擴(kuò)增 在含22 μL反應(yīng)液及1 μL Bst聚合酶的PCR反應(yīng)管中加入20 μL密封液并將2 μL模板加入密封液面以下，10 000 r/min（離心半徑25 mm）離心5 s，放入恒溫?cái)U(kuò)增儀中，63℃擴(kuò)增45 min。

1.4.1.3 結(jié)果判定 擴(kuò)增曲線呈“S”型曲線，判斷為陽(yáng)性，含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群；擴(kuò)增曲線呈一條直線或傾斜直線，判斷為陰性，不含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群或低于檢測(cè)限（1×102/mL）。

1.4.2 GeneXpert MTB/RIF 操作及判讀嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)痰液標(biāo)本的性狀，加入合適體積的標(biāo)本處理液，一般為痰液體積的兩倍，搖動(dòng)數(shù)次，并靜置10～15 min，待痰液全部溶解，吸取2 mL全部溶解的痰液至GeneXpert MTB/RIF反應(yīng)試劑盒，注意不要產(chǎn)生氣泡，將反應(yīng)盒放入Gene Xpert儀器檢測(cè)，不可將反應(yīng)盒顛倒搖晃。

1.4.3 痰涂片抗酸染色法 按照《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)計(jì)量資料采用百分比和描述，方法間配對(duì)計(jì)數(shù)資料的比較采用McNemar檢驗(yàn)和Kappa一致性檢驗(yàn)。率的比較采用χ2檢驗(yàn)。χ2檢驗(yàn)及McNemar檢驗(yàn)以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LAMP技術(shù)與痰涂片抗酸染色比較 在170例肺結(jié)核患者組中，LAMP法檢出83例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為48.8%，痰涂片抗酸染色檢出60例陽(yáng)性，陽(yáng)性率35.2%。兩種方法一致性分析，兩者一致性一般（κ=0.680）。McNemar檢驗(yàn)分析顯示，兩方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在肺結(jié)核患者組LAMP法敏感性高于痰涂片抗酸染色法，陽(yáng)性率約13%的差異。見表1。LAMP法恒溫?cái)U(kuò)增曲線圖見圖1。

圖1 LAMP法恒溫?cái)U(kuò)增曲線圖Fig.1 Graph of isothermal amplification curve using LAMP

表1 三種檢測(cè)方法的比較Tab.1 Comparison of three detection methods

2.2 LAMP法在涂陰肺結(jié)核、涂陽(yáng)肺結(jié)核及非結(jié)核患者中的比較 根據(jù)痰涂片抗酸染色的結(jié)果，將肺結(jié)核患者組分為涂陰及涂陽(yáng)肺結(jié)核兩組進(jìn)行分析。LAMP法在肺結(jié)核組與非結(jié)核組的陽(yáng)性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=60.908，P＜0.05）。110例涂陰肺結(jié)核患者中，LAMP檢出陽(yáng)性26例；60例涂陽(yáng)肺結(jié)核患者中，LAMP檢出陽(yáng)性57例；100例非結(jié)核患者中，LAMP檢出陽(yáng)性3例。LAMP法在涂陰肺結(jié)核患者、涂陽(yáng)肺結(jié)核患者及非結(jié)核患者中的陽(yáng)性率分別為23.6%（26/110）、95.0%（57/60）、3.0%（3/100）。將涂陰肺結(jié)核與涂陽(yáng)肺結(jié)核組的陽(yáng)性檢出率比較，兩組的陽(yáng)性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=79.132，P＜0.05）。涂陰肺結(jié)核組與非結(jié)核組的陽(yáng)性檢出率比較，兩組的陽(yáng)性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.741，P＜0.05）。涂陽(yáng)肺結(jié)核組與非結(jié)核患者組的陽(yáng)性檢出率比較，兩組的陽(yáng)性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=135.4，P＜0.05）。LAMP技術(shù)在涂陽(yáng)肺結(jié)核患者組的陽(yáng)性率最高。見表2。

2.3 GeneXpert MTB/RIF技術(shù)分析 GeneXpertMTB/RIF在肺結(jié)核患者組中檢出陽(yáng)性89例，其陽(yáng)性率為52.4%（89/170），其在肺結(jié)核組與非結(jié)核組的陽(yáng)性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=78.096，P＜ 0.05）。

表2 LAMP法和GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果比較Tab.2 Comparison of LAMP and GeneXpert MTB/RIF Test Results

2.4 LAMP法與GeneXpert MTB/RIF技術(shù)比較兩方法在肺結(jié)核患者組的陽(yáng)性率分別為48.8及52.4%，見表1。兩種方法一致性分析，兩者一致性最佳（κ=0.906）。McNemar檢驗(yàn)分析顯示，兩方法陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在110例涂陰肺結(jié)核患者組中，以Xpert MTB/RIF技術(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，LAMP法的敏感度為82.8%（24/29）、特異度為97.5%（79/81），總體一致率93.6%（103/110）。兩種方法一致性分析，兩者一致性最佳（κ=0.879）。McNemar檢驗(yàn)分析顯示，兩方法陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

3 討論

目前由于多重耐藥結(jié)核的增加以及HIV合并感染的出現(xiàn)等一系列的原因，結(jié)核病已成為全球性的公共衛(wèi)生難題，在我國(guó)結(jié)核病的就診人群以肺結(jié)核患者居多［1］。疑似肺結(jié)核的患者如若抗酸染色痰涂片檢測(cè)陰性，在基層診療機(jī)構(gòu)中，臨床往往需要結(jié)合痰培養(yǎng)結(jié)果以及診斷性治療的情況等才能判斷是否為結(jié)核病，但作為金標(biāo)準(zhǔn)的羅氏培養(yǎng)法通常需要4～8周的時(shí)間，耗時(shí)長(zhǎng)，敏感度較低，這無(wú)疑會(huì)增加人群感染的風(fēng)險(xiǎn)以及延誤患者的治療，因此簡(jiǎn)單快速，高效價(jià)廉的結(jié)核檢測(cè)技術(shù)對(duì)于涂陰肺結(jié)核的診斷具有重要意義。

抗酸染色痰涂片法陽(yáng)性檢出率受痰標(biāo)本質(zhì)量，取樣時(shí)間以及排菌量等的影響較大，靈敏度較低。LAMP技術(shù)通過(guò)高效DNA聚合酶識(shí)別目標(biāo)基因，在恒溫狀態(tài)擴(kuò)增45 min即可完成反應(yīng)，全過(guò)程只需2 h完成，在時(shí)間和設(shè)備上充分滿足了臨床檢測(cè)需要，特別是對(duì)于基層診療機(jī)構(gòu)而言，具有巨大優(yōu)勢(shì)。本研究結(jié)果顯示LAMP法與痰涂片抗酸染色法相比，LAMP法在肺結(jié)核組中的陽(yáng)性檢出率高，高出約13%。有研究［6］顯示，LAMP法在診斷結(jié)核病方面表現(xiàn)優(yōu)于常規(guī)涂片鏡檢，這與本研究一致。LAMP法在涂陽(yáng)肺結(jié)核患者組的陽(yáng)性率為95.0%，與涂陰肺結(jié)核患者中的陽(yáng)性檢出率為23.6%相比，LAMP法在涂陽(yáng)肺結(jié)核患者組的敏感性更高。國(guó)外研究顯示，LAMP法在涂陽(yáng)肺結(jié)核的陽(yáng)性率為92.0%，在涂陰肺結(jié)核的檢測(cè)中，涂陰比涂陽(yáng)的陽(yáng)性率低，這與本研究結(jié)果相近［9］。LAMP法在涂陽(yáng)涂陰肺結(jié)核患者組的陽(yáng)性率差別，可能是由于患者痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的量不同造成?？顾崛旧低科ú荒軈^(qū)分結(jié)核分枝桿菌及非結(jié)核分枝桿菌，調(diào)查顯示，非結(jié)核分枝桿菌感染在疑似結(jié)核的就診人群占有一定的比例［14］，應(yīng)用LAMP法技術(shù)可以在2 h內(nèi)區(qū)分出痰標(biāo)本中是結(jié)核分枝桿菌還是非結(jié)核分枝桿菌，減少了醫(yī)療差錯(cuò)的發(fā)生，這有利于臨床作出正確的診斷及制定治療方案。本次研究中痰涂片抗酸染色陽(yáng)性而LAMP法檢測(cè)陰性的樣本有可能是由非結(jié)核分枝桿菌感染所致。對(duì)于臨床常規(guī)開展的結(jié)核病檢驗(yàn)項(xiàng)目抗酸染色痰涂片法而言，其需要具有專業(yè)經(jīng)驗(yàn)的人員進(jìn)行鏡檢，效率低，而LAMP法操作簡(jiǎn)單，易于批量操作，便于準(zhǔn)確而及時(shí)的出具檢驗(yàn)結(jié)果。

GeneXpert MTB/RIF是近年來(lái)世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)推薦的結(jié)核分枝桿菌快速檢測(cè)技術(shù)，其不但可以快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌而且可以檢測(cè)利福平耐藥，本研究將LAMP技術(shù)與GeneXpert MTB/RIF這一種近年來(lái)應(yīng)用的結(jié)核分枝桿菌快速檢測(cè)技進(jìn)行比較，以此評(píng)估LAMP技術(shù)的效能。有研究顯示GeneXpert MTB/RIF在涂陽(yáng)結(jié)核患者中的診斷性高于涂陰結(jié)核患者，其在涂陰肺結(jié)核的診斷上也有很好的臨床價(jià)值［15-16］，這與本研究結(jié)果一致。LAMP技術(shù)和GeneXpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)涂陰肺結(jié)核患者組的陽(yáng)性檢出率分別為23.6%和26.4%，兩者的陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，一致性分析最佳，這表明兩種方法在涂陰肺結(jié)核中的診斷效能一致。REDDY等［7］研究數(shù)據(jù)顯示LAMP技術(shù)比GeneXpert MTB/RIF的敏感性高，本研究結(jié)果顯示，LAMP技術(shù)在肺結(jié)核組的檢出率與GeneXpert MTB/RIF無(wú)差異，這可能是人群差異造成。有研究表明痰標(biāo)本質(zhì)量對(duì)GeneXpert MTB/RIF具有影響［17］，因此痰標(biāo)本質(zhì)量也可能引起上述結(jié)果。

LAMP技術(shù)優(yōu)點(diǎn)與局限性：LAMP技術(shù)操作簡(jiǎn)單、不需要系統(tǒng)專業(yè)的培訓(xùn)、用時(shí)少、生物安全性高，與GeneXpert MTB/RIF相比檢測(cè)費(fèi)用較低，設(shè)備環(huán)境要求較低，但其不能區(qū)分死菌和活菌，且不能像GeneXpert MTB/RIF一樣在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的同時(shí)檢測(cè)耐藥，這在一定程度上影響了其臨床應(yīng)用。

綜上所述，LAMP技術(shù)在涂陰肺結(jié)核痰標(biāo)本快速檢測(cè)方面具有良好的診斷效能，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值和應(yīng)用前景。