楊勇 姜睿

1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科（四川瀘州 646000）；2遂寧市第一人民醫(yī)院泌尿外科（四川遂寧629000）

膀胱癌（bladder cancer，BCa）是泌尿系統(tǒng)腫瘤中最常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率和病死率都呈升高的趨勢(shì)［1］。目前對(duì)淺表性膀胱癌多采取手術(shù)治療的方式，但膀胱癌具有易復(fù)發(fā)、侵襲轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，導(dǎo)致膀胱癌的治療仍然是難點(diǎn)［2］。近年來膀胱癌干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)對(duì)于膀胱癌治療提供新思路，靶向治療膀胱癌干細(xì)胞對(duì)于有效根治膀胱癌至關(guān)重要，積極尋找調(diào)節(jié)膀胱癌干細(xì)胞特性的蛋白分子仍是目前研究熱點(diǎn)。

Yes相關(guān)蛋白（YAP）是Hippo信號(hào)通路中的重要組成部分，在細(xì)胞內(nèi)起到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄共激活的作用［3］。Hippo?YAP信號(hào)通路是眾多調(diào)節(jié)膀胱癌信號(hào)通路中一條重要的通路。YAP的異常表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移以及凋亡轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［4］。此外，YAP蛋白可以促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞干性相關(guān)基因活化，表明YAP在腫瘤干細(xì)胞中起到重要作用［5］，然而YAP與膀胱癌干細(xì)胞之間的關(guān)系仍未報(bào)道。

本研究通過比較正常膀胱上皮細(xì)胞及膀胱癌細(xì)胞YAP蛋白及mRNA表達(dá)差異，驗(yàn)證YAP在膀胱癌干細(xì)胞干性維持中的作用，為膀胱癌治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常膀胱上皮細(xì)胞SVHUC?1和人膀胱癌細(xì)胞株T24、253J、5637購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基和RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自以色列BI公司；YAP過表達(dá)慢病毒購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；CD133單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，YAP抗體購自美國CST公司，Nanog抗體和Oct?4抗體購自美國abcam公司，GAPDH抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基（青霉素100 IU/mL和鏈霉素100 IU/mL），置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長貼滿培養(yǎng)皿，使用0.25%胰酶消化傳代。T24細(xì)胞正常培養(yǎng)傳代，YAP過表達(dá)慢病毒預(yù)實(shí)驗(yàn)感染確定T24細(xì)胞病毒轉(zhuǎn)染MOI值。細(xì)胞計(jì)數(shù)按照1.0×105/孔接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染前用PBS清洗細(xì)胞，Complete Mdeium稀釋polybrene至50 μg/mL，細(xì)胞加入polybrene和病毒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后使用2～3 μg/mL嘌呤霉素細(xì)胞篩選2～3周，熒光顯微鏡下檢測(cè)熒光蛋白表達(dá)，Western blot和qRT?PCR檢測(cè)YAP蛋白和mRNA表達(dá)情況。

1.3 平板克隆實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以1 000個(gè)/孔接種于6孔板中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5～7 d后顯微鏡下觀察克隆形成情況并終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗，多聚甲醛固定20 min，PBS清洗后結(jié)晶紫染色30 min，緩慢沖洗后空氣干燥，拍照并計(jì)數(shù)克隆數(shù)目。

1.4 Western blot分析 將處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞消化離心后，制成細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以2×105/孔接種于6孔板中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長貼壁后取出并用4℃的PBS沖洗3次，每孔加入150 μL細(xì)胞裂解液（RIPA）裂解細(xì)胞，將刮下的細(xì)胞吸入離心管中渦旋震蕩30 s，冰上靜置10 min，于4℃離心機(jī)15 000 r/min高速離心15 min，收集上清液中的總蛋白。吸取5 μL上清液做蛋白定量，余下上清液中加入6×Loading buffer在沸水中煮沸10 min。每組吸取30 μg蛋白進(jìn)行SDS?PAGE凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)膜到PVDF膜，用含5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉1 h，加入一抗抗體4℃孵育過夜，經(jīng)TBST洗膜液10 min×3次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再用TBST洗膜液10 min×3次，使用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。目的蛋白通過與內(nèi)參蛋白GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化后得到相應(yīng)比值。

1.5 qRT?PCR 對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行消化離心后，細(xì)胞傳代于6孔板中，待細(xì)胞生長至60%～70%時(shí)按照Trizol法提取RNA。提取的RNA吸取2 μL做RNA定量，同時(shí)通過反轉(zhuǎn)錄得到穩(wěn)定的cDNA模板，反轉(zhuǎn)錄體系參照TaKaRa PrimeScriptTMRT Master Mix試劑說明書。檢測(cè)使用TaKaRa SYBR@PrimixEx TaqTMⅡ反應(yīng)體系，YAP上游引物序列為：5′?TAG?CCCTGCGTAGCCAGTTA?3′，下游引物序列為：5′?TCATGCTTAGTCCACTGTCTGT?3′。CD133上游引物序列為：5′?AGTCGGAAACTGGCAGATAGC?3′，下游引物序列為：5′?GGTAGTGTTGTACTGGGCCA?AT?3′。Nanog上游引物序列為：5′?TTTGTGGGC?CTGAAGAAAACT?3′，下游引物序列為：5′?AGGG?CTGTCCTGAATAAGCAG?3′。Oct?4 上游引物序列為：5′?CTGGGTTGATCCTCGGACCT?3′，下游引物序列 為 ：5′?CCATCGGAGTTGCTCTCCA?3′。 使 用GAPDH作為內(nèi)參，上游引物序列為：5′?GGAGC?GAGATCCCTCCAAAAT?3′，下游引物序列為：5′?GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG?3′。mRNA 的表達(dá)水平采用2?△△Ct計(jì)算方法進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用軟件SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以x±s表示，各組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常膀胱上皮細(xì)胞及膀胱癌細(xì)胞系YAP表達(dá)情況 提取正常膀胱上皮細(xì)胞SVHUC?1及膀胱癌細(xì)胞系T24、253J、5637蛋白和mRNA，通過West?ern blot和qRT?PCR檢測(cè)YAP表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YAP蛋白（圖1A）和mRNA（圖1B）在膀胱癌細(xì)胞系T24、253J、5637相對(duì)正常膀胱上皮細(xì)胞SVHUC?1高表達(dá)。

圖1 YAP蛋白及mRNA在正常膀胱上皮細(xì)胞及膀胱癌細(xì)胞系表達(dá)情況Fig.1 Expression of YAP protein and mRNA in normal bladder epithelial cells and bladder cancer cell lines

2.2 構(gòu)建T24 YAP過表達(dá)細(xì)胞系 YAP蛋白在膀胱癌細(xì)胞系T24中相對(duì)253J和5637低表達(dá)，因此應(yīng)用YAP過表達(dá)慢病毒感染T24細(xì)胞，構(gòu)建YAP過表達(dá)細(xì)胞系，通過顯微鏡下觀察（圖2A），qRT?PCR和Western blot檢驗(yàn)YAP mRNA（圖2B）和蛋白（圖2C和圖2D）表達(dá)，驗(yàn)證成功構(gòu)建YAP過表達(dá)T24細(xì)胞系。

圖2 構(gòu)建T24 YAP過表達(dá)細(xì)胞系Fig.2 T24 YAP overexpression cell lines were constructed

2.3 YAP過表達(dá)后膀胱癌細(xì)胞干細(xì)胞特性增強(qiáng) 提取T24過表達(dá)細(xì)胞系蛋白及mRNA，檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、Nanog和Oct?4表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YAP過表達(dá)后干細(xì)胞標(biāo)志物蛋白水平（圖3A）和mRNA水平（圖3B）均明顯上調(diào)；過表達(dá)細(xì)胞系進(jìn)行平板克隆實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YAP過表達(dá)后平板克隆體積增大、數(shù)量增多（圖3C和圖3D），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

膀胱癌由于其高復(fù)發(fā)率和高侵襲轉(zhuǎn)移能力，在泌尿系統(tǒng)腫瘤中嚴(yán)重影響人們的身體健康，成為導(dǎo)致患者死亡的重要原因。近年來，隨著對(duì)腫瘤干細(xì)胞研究的深入，認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞具有類似正常組織干細(xì)胞的特點(diǎn)，腫瘤干細(xì)胞具有自我更新、自我增殖及多向分化的能力［6］。同時(shí)，膀胱癌干細(xì)胞的存在，對(duì)維持膀胱癌的發(fā)生發(fā)展、增殖及侵襲轉(zhuǎn)移起著重要的作用。

腫瘤干細(xì)胞是一群具有自我更新、無限增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及多重耐藥中發(fā)揮重要功能［7］。近年來泌尿系腫瘤干細(xì)胞相關(guān)研究取得了很顯著的成果，YANG等［8］發(fā)現(xiàn)膀胱癌干細(xì)胞可能源自上皮基底干細(xì)胞的突變或非干細(xì)胞膀胱癌細(xì)胞的突變形成。目前膀胱癌干細(xì)胞表面分子標(biāo)記物研究取得長足進(jìn)步，如CD133、Nanog、Oct?4、Sox 2和ALDH1等［9］，本研究中采用CD133、Nanog和 Oct?4 進(jìn)行檢測(cè)，用于驗(yàn)證YAP改變對(duì)膀胱癌干細(xì)胞特性的影響。

圖3 T24 YAP過表達(dá)干細(xì)胞特性增強(qiáng)Fig.3 YAP enhanced stem cell characteristics of bladder cancer cells

Hippo?YAP信號(hào)通路在腫瘤干細(xì)胞中對(duì)腫瘤的干性維持起著重要的作用［10］。YAP在人體正常組織如上皮、肌肉等中有一定量的表達(dá)，但是在惡性腫瘤如肝癌［11］、乳腺癌［12］、前列腺癌［13］和腎癌［14］等中，YAP的表達(dá)水平明顯升高。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)YAP在肝癌中是維持肝癌干細(xì)胞干性的主要調(diào)節(jié)因子［15］，在卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制YAP后，卵巢癌干細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞克隆形成能力降低；當(dāng)YAP過表達(dá)后卵巢癌干細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力加強(qiáng)［16］。然而，在膀胱癌中關(guān)于YAP對(duì)膀胱癌干細(xì)胞的影響卻未見報(bào)道，本研究主要探討YAP在膀胱癌干細(xì)胞中發(fā)揮的作用。通過Western blot和qRT?PCR發(fā)現(xiàn)YAP蛋白和mRNA在膀胱癌細(xì)胞系相對(duì)正常膀胱上皮細(xì)胞高表達(dá)，提示YAP可能是膀胱癌腫瘤發(fā)生的重要因素。慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建膀胱癌YAP過表達(dá)細(xì)胞系，并使用顯微鏡下觀察熒光蛋白表達(dá)、Western blot和qRT?PCR檢測(cè)YAP蛋白驗(yàn)證YAP過表達(dá)細(xì)胞系成功構(gòu)建。為了驗(yàn)證YAP在膀胱癌干細(xì)胞特性中發(fā)揮的功能，本研究檢測(cè)YAP過表達(dá)后干細(xì)胞標(biāo)志物 CD133、Nanog和 Oct?4 表達(dá)改變，發(fā)現(xiàn)YAP 過表達(dá)后 CD133、Nanog和 Oct?4表達(dá)上調(diào)。同時(shí)使用平板克隆實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)YAP過表達(dá)后膀胱癌干細(xì)胞特性增強(qiáng)。

綜上所述，YAP在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，有可能是膀胱癌發(fā)生發(fā)展的重要分子，同時(shí)YAP水平改變對(duì)膀胱癌干細(xì)胞干性維持起到重要作用。本研究為膀胱癌靶向治療提供新靶點(diǎn)，為提高膀胱癌的總體治療水平和預(yù)后起到重要作用。