毛葦 趙心愷 孔燦燦 鄺繼孫 邱敏霞

海南省人民醫(yī)院消化科（海口 570311）

胃癌是常見(jiàn)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，發(fā)病率占全球第5位，病死率占第6位［1］。每年新發(fā)病例93.4萬(wàn)例，且35%以上出現(xiàn)在中國(guó)［2］。胃癌常采用手術(shù)治療的方法，但預(yù)后較差，復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率較高，其主要原因是胃癌細(xì)胞的惡性增殖導(dǎo)致腫瘤無(wú)法控制最終導(dǎo)致死亡，且晚期患者不易采用手術(shù)治療［3］。分子靶向治療是目前臨床研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，因此探究胃癌的發(fā)病機(jī)制，為胃病的治療提供可靠的潛在靶位點(diǎn)迫在眉睫［4］。Survivin基因?yàn)樾陆l(fā)現(xiàn)的凋亡抑制因子，通過(guò)抑制凋亡通路下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用，具有促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖的作用［5-6］。近年來(lái)隨著對(duì)Survivin基因的深入研究，其在腫瘤中的作用越來(lái)越受到人們的重視。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)Survivin基因在胃癌組織和癌旁注重中的表達(dá)量以及沉默Survivin基因?qū)ξ赴㎝KN?45細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以此探明Survivin基因促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為胃癌的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本的收集 50例胃癌和癌旁組織收集于我院2015年5月至2017年12月手術(shù)切除的患者，癌旁組織距腫瘤邊緣≥2 cm，并經(jīng)病理學(xué)確認(rèn)為胃癌。術(shù)前患者均未接受任何化療、放療等。其中男患者23例，女患者27例，平均年齡58.12歲。所有樣本的采集均獲得患者或者家屬的同意。

1.2 試劑 人胃癌MKN?45細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清、CCK8（Cell Counting Kit?8）購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)公司；脂質(zhì)體Lipofectamine2000、TRizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；Annexin V?FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；一抗、二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 Survivin基因在胃癌及癌旁組織的表達(dá)qRT?PCR測(cè)定Survivin mRNA在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)量。根據(jù)TRizol試劑說(shuō)明書(shū)提取胃癌和癌旁組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)Survivin和內(nèi)參β?actin的引物。Survivin引物上游序列為為5′?GGACCACCGCATCTCTAC?AT?3′，下游序列為5′?GCACTTTCTTCGCAGTTT?3′；β?actin 引物上游序列為 5′?GTGGGGCGCCCCAG?GCACC A?3′，下游序列為5′?CTCCTTAATGTCACG?CACGATTTC?3′。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 5 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共 40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，利用2?△△Ct法計(jì)算胃癌及癌旁組織中Survivin基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

Western blot檢測(cè)胃癌和癌旁組織中蛋白的表達(dá)量。根據(jù)蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取胃癌和癌旁組織中總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定蛋白含量。取60 μg蛋白稀釋成20 μL，加入等體積的1×SDS上樣緩沖液，沸水煮開(kāi)10 min，10%SDS?聚丙烯酰胺凝膠（SDS?PAGE）電泳，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（PVDF）上，5%的脫脂牛奶封閉30 min，加入一抗4℃過(guò)夜，次日Tris?HCl緩沖鹽溶液+Tween（TBST）洗3遍，與二抗作用2 h，用TBST洗膜3次，滴加Electro?Chemi?Lumi?nescence（ECL）電化學(xué)發(fā)光顯色液，在凝膠成像系統(tǒng)下測(cè)定灰度值。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將人胃癌MKN?45細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)中，37℃、5%CO2、飽和濕度恒溫箱中培養(yǎng)，每24 h換培養(yǎng)基，胰酶消化后，2～3 d傳代1次。

按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)，將Lipofectamine2000和siRNA按1∶1用量，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的MKN?45細(xì)胞按每孔5×105個(gè)接種至6孔板中，含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)30%～50%時(shí)轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分3組：（1）空白對(duì)照組（Normal）即未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；（2）siRNA對(duì)照組（si?Control）中加入5 μL Lipofectamine2000，5 μL錯(cuò)配的siRNA（50 nmol/L·mL）；（3）siRNA實(shí)驗(yàn)組（si?Survivin）中加入 5 μL Lipofectamine2000，5 μL siRNA?Survivin（50 nmol/L·mL）。Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.5 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每孔2 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板上，37℃、5%CO2、飽和濕度恒溫箱中培養(yǎng) 24、48、72、96 h，每孔加入10 μL CCK8溶液，37℃孵育4 h，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)每孔以空白組調(diào)零，OD450 nm處的吸光值A(chǔ)，每組4個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，加入胰酶消化，離心，PBS洗滌后加入400 μL 緩沖液，5μL Annexin V?FITC染色液，8 ℃孵育15 min；加10 μL PI染色液，8 ℃孵育15 min；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其凋亡率，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blot檢測(cè)β?catenin、Cyclin D1、Cas?pase?3蛋白的表達(dá) 從培養(yǎng)箱中取出6孔板，PBS清洗細(xì)胞，加入300 μL/孔裂解液，離心，加5×SDS上樣緩沖液，沸水煮開(kāi)10 min，離心，將提取的蛋白保存于-20℃。實(shí)驗(yàn)方法同1.3。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組差異采用t檢驗(yàn)，多組間經(jīng)單因素方差分析，組間多重比較經(jīng)SNK?q檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Survivin基因在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況 qRT?PCR檢測(cè)胃癌和癌旁組織中Survivin mRNA表達(dá)量。胃癌中Survivin mRNA表達(dá)量為3.384±0.149，癌旁組織中的表達(dá)量為0.052±0.007；經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=38.690，P＜0.05）。Western blot檢測(cè)胃癌和癌旁組織中Survivin蛋白的表達(dá)量。胃癌中Survivin蛋白的表達(dá)量為1.358±0.027，癌旁組織中的表達(dá)量為0.021±0.008，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=82.235，P＜ 0.05）。

圖1 Survivin基因在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況Fig.1 expression of Survivin gene in gastric cancer and adjacent tissues

2.2 胃癌MKN?45細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Survivin蛋白的表達(dá)量 Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組（si?Survivin）、對(duì)照組（si?Control）、空白組（Normal）胃癌MKN?45細(xì)胞中Survivin蛋白的表達(dá)水平，3組細(xì)胞中Survivin蛋白的表達(dá)水平分別為（0.203±0.015）、（0.987±0.053）、（0.936± 0.046），3組整體比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=336.276，P=0.000）。如圖2所示，si?Survivin組Survivin蛋白表達(dá)量顯著低于si?Control組、Normal組（P＜ 0.05）。

2.3 轉(zhuǎn)染后胃癌MKN?45細(xì)胞增殖情況 如圖3所示，siRNA?Survivin轉(zhuǎn)染人胃癌MKN?45細(xì)胞后，細(xì)胞增殖明顯受到抑制，增殖抑制效果隨著時(shí)間的增加越來(lái)越明顯，從48 h開(kāi)始差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），與Normal組相比，si?Survivin組72、96 h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；si?Control組與Normal組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 si?Survivin轉(zhuǎn)染胃癌MKN?45細(xì)胞后Survivin蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of Survivin protein of gastric cancer MKN?45 cells after transfected with si?Survivin

圖3 si?Survivin轉(zhuǎn)染胃癌MKN?45細(xì)胞后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.3 cell growth curve of gastric cancer MKN?45 cells after transfected with si?Survivin

2.4 轉(zhuǎn)染后胃癌MKN?45細(xì)胞凋亡情況 流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組（si?Survivin）、對(duì)照組（si?Control）、空白組（Normal）胃癌MKN?45細(xì)胞凋亡率。如圖4，表1所示，si?Survivin組MKN?45細(xì)胞凋亡率為（28.76 ± 3.46）%，si?Control組和Normal組分別為（6.38±1.03）%、（5.89±1.13）%。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示si?Survivin組細(xì)胞凋亡率顯著高于si?Control組和Normal組（P＜ 0.05）；si?Control組和Normal組間細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 轉(zhuǎn)染si?Survivin對(duì)MKN?45細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of apoptosis of MKN?45 cells after transfected with si?Survivin

表1 轉(zhuǎn)染si?Survivin對(duì)MKN?45細(xì)胞凋亡的影響Tab.1 Effect of apoptosis of MKN?45 cells after transfected with si?Survivin

2.5 轉(zhuǎn)染胃癌MKN?45細(xì)胞對(duì)β?catenin、Cyclin D1、Caspase?3蛋白表達(dá)量的影響 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染si?Survivin后胃癌MKN?45細(xì)胞caspase3、β?catenin、Cyclin D1的蛋白表達(dá)量。如圖5、表2所示，caspase?3蛋白在si?Survivin組的表達(dá)量顯著高于 Normal組和 si?Control組（P＜ 0.05）；β?catenin、Cyclin D1蛋白在si?Survivin組的表達(dá)量顯著低于Normal組和si?Control組（P＜ 0.05）。

圖5 轉(zhuǎn)染si?Survivin后Caspase3、β?catenin、Cyclin D1的蛋白表達(dá)Fig.5 The expression of Caspase3，β?catenin and Cyclin D1 protein after transfected with si?Survivin

表2 轉(zhuǎn)染si?Survivin后caspase3、β?catenin、Cyclin D1的蛋白表達(dá)量Tab.2 The expression of Caspase3，β?catenin and Cyclin D1 protein after transfected with si?Survivin ±s

表2 轉(zhuǎn)染si?Survivin后caspase3、β?catenin、Cyclin D1的蛋白表達(dá)量Tab.2 The expression of Caspase3，β?catenin and Cyclin D1 protein after transfected with si?Survivin ±s

蛋白caspase3 β?catenin Cyclin D1 Normal 0.052±0.016 0.942±0.089 0.589±0.042 si?Control 0.050±0.019 0.953±0.071 0.591±0.030 si?Survivin 0.136±0.015**0.310±0.037**0.162±0.013**F值25.753 85.095 193.986 P值0.001 0.000 0.000

3 討論

Survivin是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）的成員之一，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、以及血管形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，Survivin對(duì)細(xì)胞的強(qiáng)抑制能力成為研究的熱點(diǎn)之一［7］。腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡、增殖能力密切相關(guān)。細(xì)胞增殖、凋亡是一種復(fù)雜的生理性過(guò)程，由一系列基因、信號(hào)傳導(dǎo)通路共同作用調(diào)節(jié)，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有很重要的作用［8］。研究顯示，Survivin在多種腫瘤中高度表達(dá)如原發(fā)性肝外膽管癌［9］、膀胱癌［10］、乳腺癌［11］、食管癌［12］等，但在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)qRT?PCR和Western blot檢測(cè)胃癌組織和癌旁組織中Survivin mRNA、蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示，Survivin mRNA和蛋白在胃癌組織中高表達(dá)，但在癌旁組織中低表達(dá)，與前人的研究結(jié)果［13］一致，為胃癌的臨床診斷提供依據(jù)。

RNA干擾（RNA inference，RNAi）是一種由雙鏈RNA（diuble strand RNA，dsRNA）引發(fā)的特異性序列抑制其同源基因沉默的技術(shù)，出現(xiàn)時(shí)間雖較晚，但因其高度的專(zhuān)一性而具有廣泛的研究和應(yīng)用。目前該技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)、哺乳動(dòng)物研究中，為眾多基因功能的作用及機(jī)制的探索開(kāi)辟了新路徑。在子宮腺肌病中，Survivin的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲［6］。研究［12］顯示，抑制腫瘤組織中Survivin的表達(dá)，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其增殖，進(jìn)而提高治愈率。特異性沉默Survivin能顯著抑制胃癌MGC?803細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)其對(duì)塞來(lái)昔布的敏感性，為提高胃癌的化療效果提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)［14］。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染人胃癌MKN?45細(xì)胞，經(jīng)檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中Survivin蛋白的表達(dá)量下降，且對(duì)細(xì)胞的增殖速度起到抑制作用，促進(jìn)其凋亡，提示在胃癌的發(fā)生發(fā)展中，Survivin基因發(fā)揮癌基因的作用，為分子靶向治療胃癌提供潛在靶點(diǎn)。

天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase?3）是Caspase家族的成員之一，調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程［15-16］。Sur?vivin基因調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡主要通過(guò)參與細(xì)胞有絲分裂和直接抑制 caspase?3 活性［17］。由研究［18］報(bào)道，在白血病中誘發(fā)Caspase?3表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這對(duì)于腫瘤的治療具有重要作用。Wnt/β?catenin信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的增殖分化過(guò)程，該通路的異常與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系［19-20］。β?catenin是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)量可影響c?myc、Cyclin D1等靶基因的表達(dá)以此調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡。β?catenin蛋白的表達(dá)可作為早期診斷胃癌的指標(biāo)，其表達(dá)量可調(diào)控胃癌的發(fā)生［21］。細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）參與細(xì)胞有絲分裂過(guò)程，可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的變化［22］。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，沉默Survivin可有效降低β?catenin、Cyclin D1蛋白的表達(dá)，且Caspase?3蛋白的表達(dá)量上調(diào)，說(shuō)明Survivin可能通過(guò)與β?catenin、Cyclin D1和Caspase?3等凋亡相關(guān)蛋白共同作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡率。

綜上所述，Survivin基因和蛋白在胃癌組織中高度表達(dá)；RNA干擾沉默人胃癌Survivin基因的表達(dá)可通過(guò)抑制Wnt/β?catenin信號(hào)通路降低癌細(xì)胞的增殖及促進(jìn)凋亡。但Survivin在胃癌細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)控中的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的探討。此研究為臨床上胃癌的基因診斷及靶向性治療提供了理論基礎(chǔ)。