陳茂劍 王麗 楊偉萍 覃慶洪 譚啟杏 練斌 韋長(zhǎng)元

1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科（南寧 530021）；2柳州市人民醫(yī)院乳腺外科（廣西柳州 545006）

人類免疫缺陷病毒短轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物連接因子1（factor that binds to the inducer of short transcripts of human immunodeficiency virus?1，F(xiàn)BI?1）是一種具有原癌基因活性的轉(zhuǎn)錄抑制因子，它可調(diào)控多種腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的上游關(guān)鍵基因［1-2］。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)FBI?1參與乳腺癌MCF?7細(xì)胞的增殖：在MCF?7細(xì)胞中，F(xiàn)BI?1較正常乳腺上皮MCF?10A細(xì)胞表達(dá)增高，而沉默F(xiàn)BI?1能顯著抑制MCF?7細(xì)胞增殖［3］。本研究進(jìn)一步探討FBI?1沉默對(duì)MCF?7細(xì)胞周期和凋亡的影響及其可能機(jī)制，為尋找治療乳腺癌的策略提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人乳腺癌MCF?7細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。

1.1.2 藥品及試劑 胎牛血清（FBS）和DMEM培養(yǎng)基（Bioind公司）；細(xì)胞周期試劑盒（聯(lián)科生物）；細(xì)胞凋亡試劑盒（BD公司）；逆轉(zhuǎn)錄和qRT?PCR試劑盒（Takara公司）。引物合成由廣州艾基生物技術(shù)有限公司完成；FBI?1抗體（Abcam公司）；p53、p21和GAPDH抗體（CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌MCF?7細(xì)胞用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 慢病毒構(gòu)建 FBI?1沉默重組慢病毒顆粒及陰性對(duì)照慢病毒顆粒由蘇州吉瑪基因股份有限公司構(gòu)建，Polybrene由蘇州吉瑪基因股份有限公司提供。從所構(gòu)建的3條序列中選擇1條沉默效率最高的序列進(jìn)入本實(shí)驗(yàn)，其shRNA?FBI?1序列為GCAGCTGGACCTTGTAGATCA，shRNA?NC序列為TTCTCCGAACGTGTCACGT。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟參考本課題組前期發(fā)表的文獻(xiàn)［3］，轉(zhuǎn)染成功后收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 分別收集各組細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后制備單細(xì)胞懸液，具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，300目尼龍網(wǎng)過濾后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期情況。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 分別收集各組細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后制備單細(xì)胞懸液，具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，300目尼龍網(wǎng)過濾后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 qRT?PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 采用qRT?PCR法，F(xiàn)BI?1和GAPDH引物參考文獻(xiàn)［3］，p53和p21引物參考文獻(xiàn)［4］。反應(yīng)條件為95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，30 s；72℃，30 s；第2步至第4步進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，用2?△△CT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取各組細(xì)胞，嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作，F(xiàn)BI?1一抗1∶10 000稀釋，p53、p21和GAPDH一抗1∶1 000稀釋，ECL系統(tǒng)顯影。使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，GAPDH蛋白條帶為內(nèi)參照。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 shRNA?FBI?1慢病毒感染MCF?7細(xì)胞對(duì)FBI?1表達(dá)的影響 qRT?PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與 shRNA?NC 組比較，shRNA?FBI?1 組 FBI?1 mRNA（圖1A，1.00±0.00vs.0.33±0.01，P＜0.01）及蛋白（圖1B，1.05±0.05vs.0.59±0.02，P＜0.01）表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 shRNA?FBI?1慢病毒感染MCF?7細(xì)胞對(duì)FBI?1 mRNA（A）及蛋白（B）表達(dá)的影響Fig.1 The expressions of FBI?1 mRNA（A）and protein（B）in MCF?7 cells infected with shRNA?FBI?1

2.2 沉默F(xiàn)BI?1對(duì)MCF?7細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與shRNA?NC組比較，shRNA?FBI?1組G0/G1期細(xì)胞數(shù)明顯增加［（60.21± 0.80）%vs.（72.99±0.40）%，P＜0.01］，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)顯著減少［（27.28±0.21）%vs.（21.64±0.67）%，P＜ 0.05；（12.51±0.70）%vs.（5.37 ± 0.27）%，P＜0.01］，可見細(xì)胞被阻滯于G0/G1期。見圖2。

2.3 沉默F(xiàn)BI?1對(duì)MCF?7細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與shRNA?NC組比較，shRNA?FBI?1組細(xì)胞凋亡率顯著增加［（2.84± 0.22）%vs.（5.14±0.48）%，P＜0.01］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

2.4 沉默F(xiàn)BI?1對(duì)MCF?7細(xì)胞p53和p21 mRNA表達(dá)的影響 qRT?PCR結(jié)果顯示，與shRNA?NC組比較，shRNA?FBI?1組p53和p21 mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)（1.00±0.00vs.1.72±0.21，P＜0.01；1.00±0.00vs.1.51±0.13，P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

2.5 沉默F(xiàn)BI?1對(duì)MCF?7細(xì)胞p53和p21蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與shRNA?NC組比較，shRNA?FBI?1組p53和p21蛋白的表達(dá)顯著增加（0.60±0.04vs.1.12±0.09，P＜0.01；0.71±0.06vs.1.01±0.02，P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5。

圖2 沉默F(xiàn)BI?1對(duì)MCF?7細(xì)胞周期的影響Fig.2 The effect of silencing FBI?1 on cell cycle of MCF?7 cells

圖3 沉默F(xiàn)BI?1對(duì)MCF?7細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 The effect of silencing FBI?1 on apoptosis of MCF?7 cells

圖4 沉默F(xiàn)BI?1對(duì)MCF?7細(xì)胞p53和p21 mRNA表達(dá)的影響Fig.4 The effect of silencing FBI?1 on the mRNA levels of p53 and p21 in MCF?7 cells

3 討論

圖5 沉默F(xiàn)BI?1對(duì)MCF?7細(xì)胞p53和p21蛋白表達(dá)的影響Fig.5 The effect of silencing FBI?1 on the protein levels of p53 and p21 in MCF?7 cells

乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段的、多基因參與的復(fù)雜過程，目前其機(jī)制尚未完全闡明。隨著免疫學(xué)和基因技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，腫瘤在基因治療方面取得了巨大進(jìn)步，如何選擇治療性基因是腫瘤基因治療中最關(guān)鍵的問題。研究［5-7］發(fā)現(xiàn)FBI?1不僅在細(xì)胞分化和機(jī)體發(fā)育等多種重要生命活動(dòng)中扮演著重要角色，而且與肝癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌和鼻咽癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。FBI?1基因敲除小鼠胚胎均在胚胎期致死［8］。敲除FBI?1的鼠胚胎成纖維細(xì)胞（embryo fibroblasts，MEFs）失去了轉(zhuǎn)化和癌變的能力，而過表達(dá)FBI?1的MEFs則轉(zhuǎn)化能力增強(qiáng)，癌變速度加快［8］。LIN等［9］通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，沉默F(xiàn)BI?1明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖。YUAN等［10］研究發(fā)現(xiàn)，給grp 170?FBI?1復(fù)合體處理的肺癌小鼠，其腫瘤的生長(zhǎng)受到明顯的抑制，并且小鼠的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)。然而FBI?1對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響及機(jī)制目前尚不明確。筆者前期研究已發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)BI?1后，乳腺癌MCF?7細(xì)胞增殖能力明顯下降［3］。本研究繼續(xù)探討FBI?1與MCF?7細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡變化的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)BI?1表達(dá)后，MCF?7細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期，并且S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞凋亡率顯著增高，提示沉默F(xiàn)BI?1抑制乳腺癌增殖很可能與其阻滯細(xì)胞于G0/G1期以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，F(xiàn)BI?1可能成為治療乳腺癌的潛在靶點(diǎn)。

p53是目前研究最廣泛的抑癌基因，作為一個(gè)重要的調(diào)控因子，p53在誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡、DNA修復(fù)或細(xì)胞衰老等過程中發(fā)揮重要作用［11］。大量研究［12-13］表明，p53的抗腫瘤作用與其阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡密切相關(guān)。季玉連等［14］在研究FBI?1抑制胃癌細(xì)胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BI?1可抑制p53的表達(dá)。FENG 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BI?1過表達(dá)使肝癌細(xì)胞G2/M期細(xì)胞數(shù)明顯增多，p53和其下游因子p21表達(dá)下調(diào)，而沉默F(xiàn)BI?1可減少G2/M期細(xì)胞數(shù)，上調(diào)p53和p21表達(dá)。細(xì)胞依賴性激酶抑制劑家族的重要成員p21是p53信號(hào)通路下游因子，在DNA復(fù)制和損傷修復(fù)、細(xì)胞分化、衰老、周期調(diào)控、凋亡及腫瘤形成和發(fā)展等過程也發(fā)揮重要作用，p21可以通過細(xì)胞周期調(diào)控作用間接參與細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［15-16］。本研究結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)BI?1基因的表達(dá)后，MCF?7細(xì)胞p53和p21表達(dá)顯著增加，表明沉默F(xiàn)BI?1可能通過調(diào)控p53?p21途徑進(jìn)而阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果表明，沉默F(xiàn)BI?1可阻滯乳腺癌MCF?7細(xì)胞周期進(jìn)程和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而起到抑癌作用，其機(jī)制可能與上調(diào)p53和p21表達(dá)有關(guān)。但本研究?jī)H是FBI?1體外實(shí)驗(yàn)的初探，并且機(jī)制研究深度不夠，F(xiàn)BI?1能否作為乳腺癌防治新靶點(diǎn)尚需后續(xù)相關(guān)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及具體分子機(jī)制研究來進(jìn)一步證實(shí)，以期為以FBI?1為靶點(diǎn)的新藥開發(fā)及乳腺癌臨床防治提供更多的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。