◎ 朱 夢(mèng)，楊穗珊，林寶英

（海南省食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，海南 ?？?571700）

沙門氏菌廣泛存在于自然界中，是一種常見(jiàn)的食源性致病菌，為革蘭氏陰性桿菌，無(wú)莢膜和芽孢，屬于腸桿菌科[1]。在中國(guó)，每年由沙門氏菌引起的食物中毒占所有細(xì)菌性食物中毒事件的70%～80%，由于沙門氏菌菌體溶解時(shí)，細(xì)胞壁能夠釋放出脂多糖，從而形成內(nèi)毒素[2-3]，如果食用了污染了沙門氏菌的食物，就容易引起食物中毒，細(xì)菌會(huì)從腸道侵入血液而遍布全身，引起某些神經(jīng)癥狀以及肝、腎和心臟病變或至死亡[4-5]。因此，在食品微生物檢驗(yàn)檢測(cè)工作中，對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)意義重大。

本實(shí)驗(yàn)室參加此次國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局組織的能力考核，結(jié)合這幾年微生物檢驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，能夠分析本次沙門氏菌能力驗(yàn)證試驗(yàn)中出現(xiàn)的問(wèn)題，尋找出解決方案，為以后的檢驗(yàn)檢測(cè)工作提供必要的參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

3份考核樣品，編號(hào)為CODE0375、CODE0770、CODE0766，每份樣品為一塊瓶裝巧克力，裝量約為10g，采用玻璃瓶包裝。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、三糖鐵（TSI）瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、Swarm瓊脂、半固體培養(yǎng)基、沙門氏菌生化鑒定試劑盒（廣州環(huán)凱生物科技有限公司）、VIDAS沙門氏菌（SLM）試劑條，VITEK2革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡（法國(guó)梅里埃公司）、沙門氏菌陽(yáng)性菌株鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）以及沙門氏菌屬診斷血清（寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司，丹麥SSI公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

按照考核方的作業(yè)指導(dǎo)書(shū)中的要求處理樣品。樣品處理好以后,依據(jù)GB 4789.4-2016《食品全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué) 沙門氏菌檢驗(yàn)》[6]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到疑似純菌落后進(jìn)行血清分型。全自動(dòng)熒光免疫分析系統(tǒng)（MINI VIDAS）和全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK2）作為實(shí)驗(yàn)輔助儀器進(jìn)行篩選和鑒定，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果后報(bào)告。

1.3.1 樣品的前處理

在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，需要準(zhǔn)備90 mL預(yù)熱至45 ℃的BPW：首先將滅菌的BPW加入檢樣瓶中，待巧克力融化后再加入無(wú)菌均質(zhì)袋中。取20 mL滅菌的BPW清洗檢樣瓶，將洗液加入均質(zhì)袋內(nèi)，再取20 mL滅菌BPW重復(fù)清洗一次，最后向均質(zhì)袋內(nèi)加入30 mL滅菌BPW，充分均質(zhì)混勻，制成1∶10稀釋液。依此方法，分別對(duì)3件樣品進(jìn)行前處理。將編好號(hào)的BPW增菌液、陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照一同放入36 ℃培養(yǎng)箱中18 h。

1.3.2 增菌培養(yǎng)

在10 mL TTB 和10 mL SC內(nèi)，分別轉(zhuǎn)接1 mL BPW培養(yǎng)物，并分別放入（42±1）℃培養(yǎng)箱和36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。同時(shí)取0.5 mL滅活的BPW增菌液加入到沙門氏菌（SLM）試劑條中，按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.3 選擇性分離

將TTB、SC增菌液接種到XLD瓊脂平板、BS瓊脂平板和沙門顯色培養(yǎng)基上，放入36 ℃培養(yǎng)箱中，BS瓊脂平板培養(yǎng)48 h，XLD瓊脂平板和沙門顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察平板上的菌落特征，判定有無(wú)可疑菌落生長(zhǎng)。

1.3.4 生化鑒定實(shí)驗(yàn)

在每個(gè)平板上選取3個(gè)疑似菌落，接種于三糖鐵（TSI）斜面上，同時(shí)接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行純化，36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將純化后的菌落用沙門氏菌生化鑒定試劑盒和VITEK2鑒定。

1.3.5 血清學(xué)鑒定

先檢查培養(yǎng)物是否有會(huì)自凝，在玻片上滴一滴生理鹽水，將菌落涂在水滴中，等待30～60 s后，若出現(xiàn)菌體凝集，則有自凝性。沒(méi)有自凝現(xiàn)象的菌落才做血清學(xué)鑒定。

（1）O抗原鑒定。O抗原可與相應(yīng)抗體呈顆粒狀反應(yīng)。挑取一環(huán)待測(cè)菌涂在玻片的兩個(gè)區(qū)域內(nèi)，分別滴加A～F多價(jià)O血清和生理鹽水各一滴，將混合液混勻等待1 min后，觀察是否有凝集現(xiàn)象。被多價(jià)O血清凝集后，按照沙門氏菌屬診斷血清說(shuō)明書(shū)中的要求依次凝集OMA、OMB、OMC、OMD，來(lái)判定O群。隨后繼續(xù)做H抗原凝集實(shí)驗(yàn)。H抗原與對(duì)應(yīng)抗體凝集后呈絮狀，大多數(shù)沙門氏菌的H抗原有兩相。如果遇到H相不凝集時(shí)，應(yīng)該先恢復(fù)動(dòng)力。如果恢復(fù)動(dòng)力后還不能凝集，則需誘導(dǎo)后再做。

（2）動(dòng)力恢復(fù)試驗(yàn)。取疑似菌落，接種到半固體瓊脂上，取菌落最邊緣的部分進(jìn)行凝集試驗(yàn)。

（3）平板誘導(dǎo)法。加入1～2滴已凝集的誘導(dǎo)血清至Swarm培養(yǎng)基中，混合均勻，將待凝集菌株接種到板中央，36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。挑取菌落最邊緣的部位進(jìn)行H相鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 MINI VIDAS全自動(dòng)熒光免疫分析結(jié)果

MINI VIDAS的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性對(duì)照鼠傷寒沙門 氏 菌（ATCC14208）、CODE0375、CODE0770、CODE0766均為沙門氏菌陽(yáng)性（見(jiàn)表1）。

表1 MINI VIDAS檢測(cè)結(jié)果表

2.2 增菌后選擇性分離的結(jié)果

增菌劃線分離后，平板觀察結(jié)果，編號(hào)為CODE0375、CODE0770、CODE0766的培養(yǎng)基平板上均出現(xiàn)可疑菌落特征。各平板上菌落特征結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 選擇性培養(yǎng)基上的菌落特征表

2.3 生化實(shí)驗(yàn)和VITEK2鑒定結(jié)果

將純化后的菌落進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)和VITEK2鑒定，結(jié)果均與沙門氏菌屬生化特性一致，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 生化實(shí)驗(yàn)和VITEK2鑒定結(jié)果表

2.4 血清分型結(jié)果

參照GB 4789.4-2016中血清學(xué)分型鑒定要求對(duì)CODE0375、CODE0770、CODE0766三個(gè)樣品進(jìn)行血清分型，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 血清分型結(jié)果表

3 結(jié)論與討論

能力驗(yàn)證是保證實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量的一種必要手段。各個(gè)實(shí)驗(yàn)室參與能力驗(yàn)證，可了解承檢實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而提高各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平，確保檢測(cè)質(zhì)量[7-8]。各個(gè)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)參加能力驗(yàn)證，可以發(fā)現(xiàn)自身在檢驗(yàn)工作中存在的問(wèn)題，并進(jìn)行改進(jìn)和糾正[9]。

此次能力驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)室除了按照GB 4789.4-2016規(guī)定的方法鑒定以外，還運(yùn)用了全自動(dòng)熒光免疫分析結(jié)果（MINI VIDAS）作為輔助，對(duì)樣品進(jìn)行初篩。MINI VIDAS可以直接使用增菌液上機(jī)檢測(cè)，避免人工檢測(cè)過(guò)程中造成假陰性，可與傳統(tǒng)方法相互補(bǔ)充，防止漏檢[10]。在本次實(shí)驗(yàn)中，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用了國(guó)產(chǎn)寧波天潤(rùn)和丹麥SSI公司兩種品牌的血清相互驗(yàn)證[11]。沙門顯色培養(yǎng)基對(duì)沙門氏菌屬有很高的特異性，對(duì)沙門菌種的分離和判定都有很大的幫助，對(duì)一些與沙門氏菌很相似的變形桿菌都能夠很直觀地區(qū)分開(kāi)[12-13]。

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，一定要注意對(duì)所有試劑進(jìn)行驗(yàn)收，驗(yàn)收合格以后才能使用。按照GB4789.28-2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》來(lái)進(jìn)行驗(yàn)收[14]。目前食品微生物的檢驗(yàn)方法有傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法，免疫學(xué)法和分子生物學(xué)檢測(cè)法三種。這三種方法各有優(yōu)點(diǎn)，在檢驗(yàn)工作中可相互補(bǔ)充和輔佐，以提高檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性。