周 強(qiáng)，劉蒙佳

（福建師范大學(xué)閩南科技學(xué)院，福建 泉州 362332）

微藻（microalgae）培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)周期短，光合效率高，整個(gè)生命體都可以轉(zhuǎn)化成對(duì)人類(lèi)健康有益的生物制品，其在食品及環(huán)境保護(hù)等方面得到了廣泛的應(yīng)用［1-3］。研究表明，微藻在異養(yǎng)條件下，其細(xì)胞內(nèi)油脂含量可達(dá)50%以上［4-5］，將其轉(zhuǎn)化為生物柴油可為新能源的開(kāi)發(fā)和利用提供新途徑。生物柴油是可再生資源，作為石油燃料的替代品，具有良好的應(yīng)用前景［6-7］。微藻在光自養(yǎng)培養(yǎng)的過(guò)程中可固定大量的CO2，可大幅度降低微藻光自養(yǎng)生長(zhǎng)所需碳源［8］。微藻光自養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程可利用廢水中的N、P等營(yíng)養(yǎng)元素，從而降低水體的富營(yíng)養(yǎng)化，并且可使微藻生長(zhǎng)所需的N、P源成本顯著降低［9］。此外，微藻可以利用灘涂、鹽堿地、荒漠以及海水、鹽堿水和荒漠區(qū)的地下水等進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)［10-11］。與能源植物相比，微藻富含色素、多糖和蛋白質(zhì)等高附加值產(chǎn)品，其綜合利用價(jià)值更高［12］。

該試驗(yàn)對(duì)微藻FACHB-1067在3種不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)性狀和油脂積累情況進(jìn)行初步觀察，通過(guò)建立藻液吸光度值與藻液濃度的線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)關(guān)系，探究其生產(chǎn)期內(nèi)生物積累量和比生長(zhǎng)速率，并確定其富油量及產(chǎn)油率，以期為微藻的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

表1 微藻OD685nm值與菌液濃度的關(guān)系

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1藻種：小球藻（微藻FACHB-1067），購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。

1.1.2培養(yǎng)基：試驗(yàn)所用培養(yǎng)基共有3種，分別為SE、BG11-N 和 BG11。

1.1.3試劑：氯仿、甲醇等均為分析純。

1.1.4主要儀器及設(shè)備：752N型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海儀電分析有限公司），XSP-2CA生物顯微鏡 （江西鳳凰光學(xué)儀器有限公司），KQ5200E型超聲波清洗器（昆山舒美有限公司），F(xiàn)D-1冷凍干燥機(jī)（上海金舍儀器有限公司），250D數(shù)顯光照培養(yǎng)箱（常州首創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1微藻FACHB-1067的擴(kuò)培：將購(gòu)買(mǎi)的微藻FACHB-1067以藻液∶培養(yǎng)基=1∶4的比例進(jìn)行擴(kuò)培，將進(jìn)入穩(wěn)定期的微藻FACHB-1067藻液作為試驗(yàn)研究的種子液。

1.2.2微藻FACHB-1067最高吸收峰的測(cè)定［13］：將種子液適度稀釋后，分別在 625、645、665、685、705、725、745、760 nm 波長(zhǎng)下用 752N 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定微藻FACHB-1067稀釋菌液的吸光度值（OD值）。

1.2.3微藻FACHB-1067的培養(yǎng)：按照參考文獻(xiàn)［14］進(jìn)行。

1.2.4微藻FACHB-1067藻液OD值和藻液濃度的測(cè)定：取少量藻液，根據(jù)實(shí)際需求，以不同比例將藻液稀釋成不同濃度，使OD值在0.10～0.60。以1 cm×1 cm的比色皿為容器，用752N型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定各組OD值，對(duì)照液使用相對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基。用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算出微藻藻液的濃度，藻液濃度計(jì)算公式為［15］：

式中，A表示5個(gè)中方格中的總菌數(shù)；B表示藻液的稀釋倍數(shù)。

1.2.5微藻FACHB-1067生物量的測(cè)定：當(dāng)微藻FACHB-1067培養(yǎng)至12 d時(shí)，將各組微藻藻液移入已知干重的50 mL玻璃離心管中，以6 000 r/min離心30 min，棄上清液。用無(wú)菌蒸餾水洗滌藻泥，并再次以6 000 r/min離心30 min，重復(fù)3次獲得藻泥。將藻泥經(jīng)冷凍干燥后，用電子天平稱(chēng)量離心管質(zhì)量，計(jì)算出干重，重復(fù)2次，取平均值［16］。干重和生物量計(jì)算公式為：

小球藻干重=m2-m1

小球藻生物量=小球藻干重/離心時(shí)藻液的體積

式中，m2代表裝有冷凍干燥藻泥的玻璃離心管重，m1代表空玻璃離心管重。

1.2.6比生長(zhǎng)速率的計(jì)算：按照公式μ=（lnN2-lnN1）（t2-t1）。 式中，μ 代表比生長(zhǎng)速率，N1代表接種時(shí)藻液細(xì)胞密度，N2代表培養(yǎng)結(jié)束時(shí)藻液細(xì)胞密度，（t2-t1）代表藻液接種完畢到培養(yǎng)結(jié)束之間的時(shí)間間隔［17］。

1.2.7微藻FACHB-1067油脂的測(cè)定：按照參考文獻(xiàn)［18］進(jìn)行，計(jì)算公式為：

油脂含量=油脂質(zhì)量/（干藻粉質(zhì)量）×100%

油脂產(chǎn)率=總脂質(zhì)量/（培養(yǎng)體積×培養(yǎng)天數(shù)）

2 結(jié)果與分析

2.1 微藻FACHB-1067在3種培養(yǎng)基中的OD685nm值與菌液濃度線(xiàn)性回歸

微藻在3種培養(yǎng)基中的稀釋倍數(shù)、平均OD685nm值和菌液濃度見(jiàn)表1。以O(shè)D685nm值為橫坐標(biāo)（x），以菌液濃度為縱坐標(biāo)（y），建立微藻藻液在BG11-N培養(yǎng)基中的OD685nm值與其相應(yīng)菌液濃度的回歸方程：y=2.2705x-0.4261，R2=0.9875；建立微藻藻液在SE培養(yǎng)基中的OD685nm值與其相應(yīng)菌液濃度的回歸方程：y=2.2266x-0.187，R2=0.9973； 建立微藻藻液在BG11培養(yǎng)基中的OD685nm值與其相應(yīng)菌液濃度的回歸方程：y=2.218x-0.4267，R2=0.9968。 利用3種培養(yǎng)基培養(yǎng)微藻FACHB-1067獲得的藻液OD685nm值與相應(yīng)菌液濃度均呈線(xiàn)性關(guān)系，且線(xiàn)性相關(guān)程度高。

2.2 3種培養(yǎng)基對(duì)微藻FACHB-1067生長(zhǎng)性狀的影響

微藻FACHB-1067在3種培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 d后的生長(zhǎng)密度見(jiàn)表2。培養(yǎng)基的組分對(duì)微藻FACHB-1067的生長(zhǎng)有著重要的影響。3種培養(yǎng)基中的生物積累量與培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)，且各時(shí)間水平間的生物積累量差異顯著（P＜0.05）。不同的培養(yǎng)基對(duì)微藻的比生長(zhǎng)速率、生物量的影響都各不一樣。微藻在3種培養(yǎng)基中的比生長(zhǎng)速率由大到小分別是：μSE＞μBG11-N＞μBG11， 微藻 FACHB-1067在SE培養(yǎng)基中的比生長(zhǎng)速率最快，為1.052/d。而測(cè)得的生物積累量由大到小分別是：SE（2.532 g/L）＞BG11（2.032 g/L）＞BG11-N（1.916 g/L）。 由此可見(jiàn)，SE培養(yǎng)基在比生長(zhǎng)速率和生物積累量上的表現(xiàn)較理想。

表2 微藻FACHB-1067在3種培養(yǎng)基中的生物積累量

表3 微藻FACHB-1067在3種培養(yǎng)基中的油脂含量和油脂產(chǎn)率

2.3 3種培養(yǎng)基對(duì)微藻FACHB-1067油脂積累的影響

微藻FACHB-1067在3種培養(yǎng)基中的油脂含量和油脂產(chǎn)率見(jiàn)表3。微藻FACHB-1067在BG11培養(yǎng)基中的油脂含量和油脂產(chǎn)率最高，分別為28.64% 與 16.28 mg/（L·d）， 且 顯 著 高 于 其 在BG11-N與SE培養(yǎng)基中的油脂含量及油脂產(chǎn)率（P＜0.05）。 BG11-N與 SE培養(yǎng)基相比， 微藻FACHB-1067的油脂含量差異不顯著 （P＞0.05），但油脂產(chǎn)率差異顯著（P＜0.05）。

3 結(jié)論

SE培養(yǎng)基在比生長(zhǎng)速率和生物積累量上的表現(xiàn)較理想，而B(niǎo)G11培養(yǎng)基在油脂含量和油脂產(chǎn)率上的表現(xiàn)較理想。