尹向田 ，曲靜，張子文 ，湯小寧 *

（1.山東省葡萄研究院，山東省葡萄栽培與精深加工工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100；2.濟(jì)南文旅花木開發(fā)有限公司，山東 濟(jì)南 250100）

目前，我國(guó)核桃栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位，隨著核桃種植面積地持續(xù)增加，核桃青皮污染日趨嚴(yán)重，這些青皮多數(shù)被倒在路旁、水溝邊，隨著雨水的沖刷，流進(jìn)了江、河、湖泊、農(nóng)田等，對(duì)水資源和動(dòng)植物的生存造成極大危害[1]。核桃青皮含有多種生物堿、鞣質(zhì)、多酚類、黃酮類、單寧類、香豆類、萜類、甾類和有機(jī)酸物質(zhì)等多種生理活性成分，還含有揮發(fā)油、脂肪酸、核桃多糖、胡桃醌及其衍生物等化學(xué)成分，具有一定的植物源農(nóng)藥活性。外皮中還含有較多的鉀元素，在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、色素提取等方面都有廣泛的應(yīng)用[2,3]。

在發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)和綠色食品的今天，采用植物源殺菌劑在農(nóng)作物病蟲害防治中越來越受重視。相比化學(xué)殺菌劑，植物源抑菌劑兼具抑菌效果好和安全的特性。許牡丹等[4]用超聲波輔助法提取的薺菜多糖對(duì)鏈格孢菌有良好的抑菌活性，張苓花等[5]采用豆蔻浸提液用于草莓保鮮，抑菌率達(dá)69%以上。天然植物抑菌劑在食品、化妝品領(lǐng)域研究較多，在防治葡萄病害方面研究較少。對(duì)于葡萄病害的控制，目前除了加強(qiáng)田間管理外，使用較多的還是波爾多液、多菌靈、百菌清、甲基托布津、甲霜靈等化學(xué)藥劑[6,7]，利用核桃青皮中含有的活性物質(zhì)對(duì)葡萄病原菌產(chǎn)生抑制作用的研究鮮見報(bào)道。而當(dāng)前對(duì)核桃青皮的研究也主要集中在提取有效活性物質(zhì)上，大多采用溶劑提取、減壓蒸餾、冷浸和熱回流等方法[8-10]，這些方法存在提取率低、能耗大等缺點(diǎn)，而對(duì)核桃青皮整體處理的研究和技術(shù)較少，將其資源化的實(shí)踐更少。本研究以廢棄的核桃青皮為原料，利用核桃青皮中含有種類較為豐富的對(duì)真菌具有抑菌活性的次生代謝物質(zhì)，研發(fā)出植物源殺菌劑，并研究其在葡萄生產(chǎn)上的防控技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了核桃青皮廢棄物的資源化高效利用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella）、葡萄炭疽病菌（Gloeosporium fructigrum）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、葡萄枝枯病菌（Pestalotia menezesiana）、葡萄穗軸褐枯病菌（Alternaria viticola）、葡萄蔓枯病菌（Phomopsis viticola）、葡 萄潰 瘍 病 菌（Botryosphaeria dothidea）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、粉紅聚端孢（Trichothecium roseum）、 尖 鐮 刀 病 菌（Fusarium oxysporum）于山東省葡萄研究院良種與栽培研究室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L。

1.1.3 材料與試劑

核桃采自山東省濟(jì)南市仲宮鎮(zhèn)核桃園村，試驗(yàn)于2016年8月～2017年12月在山東省葡萄研究院進(jìn)行。

硼酸硫酸鋅，分析純，購(gòu)自于國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司，多寧77%硫酸銅鈣可濕性粉劑，購(gòu)自于江蘇龍燈化學(xué)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 核桃青皮抑菌劑制備

將未使用乙烯利催熟劑脫皮的核桃鮮青皮使用榨汁機(jī)進(jìn)行破碎、過濾后取清汁，進(jìn)行真空濃縮5倍備用，濃縮壓力為0.08 MPa，溫度為75℃。濃縮后每1 L清汁中加入0.5 g硼酸和2.5 g硫酸鋅。

1.2.2 核桃青皮抑菌劑對(duì)指示真菌的抑制作用

采用菌絲生長(zhǎng)速率法：將核桃鮮青皮抑菌劑與PDA培養(yǎng)基分別按1:5、1:10、1:50體積比混合，制作PDA平板，在平板中央接d=0.5 cm的指示菌菌碟，以未加抑菌劑的PDA培養(yǎng)基平板為對(duì)照，25℃下培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，5 d后計(jì)算抑菌率，抑菌率的計(jì)算公式見式（1）。挑取處理及對(duì)照的病原菌菌絲，在光學(xué)顯微鏡下觀察無菌發(fā)酵液對(duì)菌絲形態(tài)的影響并進(jìn)行拍照。

1.2.3 菌株GSBM05對(duì)葡萄白腐病的防治作用

選取健康的葡萄葉片，先用自來水沖洗干凈，再用75%酒精消毒，晾干后將葉片放入鋪有無菌濾紙的直徑為100 mm的培養(yǎng)皿中，加入無菌水保濕，每個(gè)處理葉片10片，重復(fù)3次。取葡萄白腐病菌的孢子懸浮液與核桃青皮抑菌劑10倍液等體積加入到離心管中混勻得到接種液，以市面上常用的多寧可濕性粉劑800倍液及無菌水作為對(duì)照。用消毒接種針在每個(gè)葉片刺傷4～5個(gè)傷口，在傷口處分別接種50 μL接種液，28℃保濕培養(yǎng)，每天進(jìn)行病害統(tǒng)計(jì)并計(jì)算防治效果，計(jì)算公式見式（2）（3）。葉片病害分級(jí)方法：0級(jí)：無病斑；1級(jí)：病斑面積占整片葉面積的5%以下；3級(jí)：病斑面積占整片葉面積的6%～15%以下；5級(jí)：病斑面積占整片葉面積的16%～25%以下；7級(jí)：病斑面積占整片葉面積的26%～50%以下；9級(jí)：病斑面積占整片葉面積的50%以上。

1.2.4 核桃青皮抑菌劑抑菌譜的測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)法，核桃青皮抑菌劑與PDA混合稀釋10倍測(cè)定其對(duì)10種供試病原菌的抑制作用，計(jì)算抑菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃青皮抑菌劑對(duì)葡萄白腐病菌的抑制作用

核桃青皮汁對(duì)葡萄白腐病菌的菌絲生長(zhǎng)有強(qiáng)烈的抑制作用，并且抑制效果與濃度呈正相關(guān)。稀釋5倍、10倍、50倍的核桃青皮抑菌劑對(duì)白腐病菌的抑制率分別為100%、78.1%、50.8%。純濃縮汁的抑制率為70.1%。分別挑取對(duì)照和處理菌落邊緣菌絲置于顯微鏡下觀察，結(jié)果見圖2，發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理后的菌絲嚴(yán)重畸形，菌絲斷裂、頂端膨大成球形，有的菌絲呈念珠狀。對(duì)照處理的菌絲生長(zhǎng)正常，有明顯的分隔，無畸形現(xiàn)象。

圖1 核桃青皮抑菌劑對(duì)葡萄白腐病菌的抑制作用Fig.1 The inhibiting effect of antimicrobial agent of green walnut husk against grape white rot

2.2 核桃青皮抑菌劑對(duì)葡萄白腐病菌的防治效果

施藥后接種病原菌的3個(gè)處理中，核桃青皮抑菌劑10倍液和多寧800倍液的防治效果較好，發(fā)病率和防效分別為9.4%、94.6%和3.2%、96.7%。青皮汁的防治效果低于核桃青皮抑菌劑，但防治效果也在85%以上，可見，青皮汁本身對(duì)葡萄白腐病菌就有較好的防治效果，在經(jīng)過處理制成核桃青皮抑菌劑之后，防治效果更明顯。

圖2 核桃青皮抑菌劑處理后葡萄白腐病菌菌絲生長(zhǎng)情況Fig.2 The growth of the mycelium of grape white rot treated with antimicrobial agent of green walnut husk

表2 核桃青皮抑菌劑對(duì)葡萄離體果實(shí)白腐病的防治效果Table 2 The control effect of antimicrobial agent of green walnut husk against on vitro grape fruit

2.3 核桃青皮抑菌劑抑菌譜測(cè)定

測(cè)定結(jié)果表明，核桃青皮抑菌劑稀釋10倍后對(duì)10種供試植物病原真菌具有不同的抑菌活性，具體見表3。其中，對(duì)葡萄白腐病菌和粉紅聚端孢的抑菌活性最強(qiáng)，分別為99.2%和100%。其次對(duì)葡萄灰霉病菌和立枯絲核菌的抑菌率也較強(qiáng)，均為88%以上，對(duì)葡萄枝枯病菌和葡萄炭疽病菌的抑菌率較差，分別為10.1%、34.9%。對(duì)其它病原菌的抑菌率在53.4%～72.3%之間。

表3 核桃青皮抑菌劑抑菌譜測(cè)定Table 3 Antagonistic activity of antimicrobial agent of green walnut husk against fungi direction

3 討論

本研究研制成核桃青皮抑菌劑中，硼、鋅是葡萄生長(zhǎng)的重要元素，具有營(yíng)養(yǎng)作用，還具備抑菌的作用。羅錦等[11]研究表明，外源硼酸對(duì)柑橘采后病害有良好的防治效果，周毅等[12]發(fā)現(xiàn)，硫酸鋅處理后能刺激玉米種子中物質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)養(yǎng)分積累。核桃青皮抑菌劑制備中選用的螯合劑為亞氨基二琥珀酸四鈉IDS，它是新近出現(xiàn)的新型氨基酸基螯合劑，與EDTA、DTPA和NTA等同屬氨基多羧酸類螯合劑的替代產(chǎn)品，環(huán)保高效，易溶于水，易吸收，無拮抗作用，是一種新型綠色環(huán)保的絡(luò)合劑[13]。

本試驗(yàn)制備的核桃青皮抑菌劑對(duì)葡萄白腐病菌等多種葡萄相關(guān)的病原菌均具有良好的抑制作用，這在國(guó)內(nèi)研究尚屬首次。核桃青皮抑菌劑的研制不僅合理有效的解決了核桃青皮對(duì)環(huán)境的污染，變廢為寶，保護(hù)和改善了農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，獲得了生態(tài)效益，而且還開發(fā)出了高附加值的產(chǎn)品，有較高的經(jīng)濟(jì)效益。