崔益瑋，俞喜娜，李詩言，王 揚，戴志遠，張燕平，陳 康，沈 清,*

（1.浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室，浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2.浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心，浙江 杭州 310023）

我國蝦類資源十分豐富，但在加工過程中，蝦頭常因口感堅硬而作為加工廢物處理或僅用于生產(chǎn)飼料[1]。這些不被用于食品加工的蝦頭、殼等可占到蝦體總質(zhì)量的30%～40%[2]，據(jù)報道，我國僅廣東省湛江市每年蝦加工下腳料就達到了3萬 t[3]。研究顯示，蝦頭中含有的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、蝦紅素及必需微量元素等物質(zhì)均對人體健康有重要作用[4-6]。因此，對于蝦頭的研究不僅可以充分利用其中的營養(yǎng)物質(zhì)、擴大其經(jīng)濟價值，還可以減少資源浪費、降低環(huán)境壓力[7]。

蝦頭中含有豐富的磷脂。磷脂廣泛存在于包括細菌、動植物等各種生物體內(nèi)[8]。它是維持細胞結(jié)構(gòu)的重要組成部分[9]，也是新陳代謝不可或缺的營養(yǎng)元素[10]。實驗證明，磷脂可以活化細胞，維持代謝與荷爾蒙分泌均衡，分解血脂、膽固醇，阻止多余脂肪在血管壁沉積，改善受損的胰島B細胞及周圍的組織結(jié)構(gòu)[11-14]。

脂質(zhì)組學(xué)研究內(nèi)容包括生物體內(nèi)脂質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)鑒定與定量，及其在生物代謝、疾病、免疫等所扮演的角色分析[15-16]。隨著軟電離離子化技術(shù)和高分辨質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展及其在脂質(zhì)分析中的應(yīng)用，已經(jīng)實現(xiàn)了對生物樣品中各種微量脂質(zhì)進行快速、高精度的分析檢測，極大地促進了規(guī)模性、整體性的脂質(zhì)分析[17]。目前，脂質(zhì)組學(xué)研究已成為一個前景廣闊的熱門領(lǐng)域，但其在食品科學(xué)領(lǐng)域的研究則相對較少[18-19]。因此，開展蝦頭脂質(zhì)組學(xué)研究為海洋食品研究與開發(fā)提供了一個嶄新的視角。

目前，最常使用的磷脂提取方法為Folch法和Bligh &Dyer法[20]。邊晶晶等[21]利用Folch法提取蝦頭中的磷脂；盧航等[22]利用Folch法提取鮰魚腦中的磷脂；陳康等[23]利用超聲輔助Bligh & Dyer脂質(zhì)提取法提取南極磷蝦中磷脂；鄒舟等[24]利用Bligh & Dyer法提取鰱（Hypophthalmichthys molitrix）各組織部位中的磷脂。除此之外，Shen Qing等[7]通過二氧化鈦包覆二氧化硅（TiO2/SiO2）核殼復(fù)合材料作為吸附劑，采用固相萃取法提取蝦副產(chǎn)物中的磷脂。然而這些方法或使用毒性較強的試劑作為溶劑，或方法過于繁瑣而不適用于食品工業(yè)。乙醇提取法因其提取劑乙醇毒性小、易揮發(fā)、可回收反復(fù)使用而被廣泛應(yīng)用于食品、藥品工業(yè)中[25-27]。劉大川等[28]利用乙醇浸提法提取紫蘇壓榨餅中的油脂；Ristíc等[29]利用乙醇浸提法提取橙花糙蘇（Phlomis fruticosa L.）中的活性物質(zhì)，并檢測其對于人類、動植物病原體以及引起食物中毒的細菌和真菌的抑菌效果。Lei Lin等[30]通過硅膠柱層析，完全采用乙醇法從母雞蛋黃中分離提取磷脂。

本研究建立并優(yōu)化乙醇浸提法提取蝦頭中的磷脂，并通過組學(xué)技術(shù)對磷脂分子種類及脂肪酸鏈結(jié)構(gòu)進行脂質(zhì)組學(xué)分析。目的在于探索適用于蝦頭加工業(yè)的食品級磷脂提取方法，從分子結(jié)構(gòu)揭示蝦頭磷脂營養(yǎng)，為磷脂提取提供新思路的同時達到資源的充分利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦頭樣品購于杭州物美超市，經(jīng)鑒定蝦種為中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）；蝦頭去殼取內(nèi)容物于4 ℃冷藏備用。

甲酸（色譜純） 美國Tedia公司；乙腈（質(zhì)譜級）德國Merck公司；磷脂酰膽堿（phosphatidyl choline，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）、磷脂酰肌醇（phosphatidyl inositol，PI）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）、磷脂標準品（純度≥99.9%） 美國Avanti公司；乙醇（分析純）中國西隴化工股份有限公司；超純水系統(tǒng)（電阻率18.2 MΩ·cm） 美國Milli-Q公司。

1.2 儀器與設(shè)備

渦旋混勻器 北京金紫光公司；AL204電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；落地式高速冷凍離心機 美國Thermo公司；Acquity高效液相色譜儀美國Waters公司；4000QTRAP串聯(lián)四極桿質(zhì)譜（配電噴霧離子源） 美國AB Sciex公司；離心管等耗材杭州常盛科教器具廠。

1.3 方法

1.3.1 蝦頭磷脂提取

將蝦頭組織勻漿后精確稱量100.00 g樣品于500 mL離心管中，加入250 mL 70%乙醇溶液后振蕩混勻，在20 ℃的恒溫水浴鍋中浸提10 min?；旌衔镉美鋬鲭x心機以9 000 r/min離心10 min，離心后用移液管將上清液轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶內(nèi)，在下層組織樣品中再次加入150 mL 70%乙醇溶液二次萃取，并重復(fù)2次。合并3次提取所得上清液，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于65 ℃將有機溶劑蒸干得到蝦油濃縮液，冷卻后向其中加入提前預(yù)冷過的500 mL丙酮，振蕩萃取后移入1 000 mL離心瓶中，以8 000 r/min離心6 min，轉(zhuǎn)移溶液后將磷脂沉淀物蒸干并稱質(zhì)量。取磷脂樣品用乙腈復(fù)溶后用于液相色譜和質(zhì)譜分析。磷脂提取量按下式進行計算：

1.3.2 磷脂提取條件優(yōu)化

在其余提取條件均不變的前提下，將蝦頭組織分為3 組。第1組樣品分別以乙醇體積分數(shù)70%、80%、85%、90%、95%、100%進行提取；第2組樣品分別在20、30、40、50、60 ℃的恒溫水浴鍋中浸提；第3組樣品在恒溫水浴鍋中的提取時間分別設(shè)置為10、20、30、40、50、60 min，對上述樣品對比最終磷脂提取量。由此優(yōu)化得到各單因素最佳提取條件。

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，分別選取乙醇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間3 個單因素最佳值及其前后相鄰值作為試驗因素，并選取磷脂提取量作為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，得到磷脂提取最優(yōu)條件。試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface methodology (RSM)

1.3.3 樣品甲酯化

將0.1 g磷脂與2 mL的NaOH-甲醇溶液（0.5 mol/L）混合后振蕩搖勻，在65 ℃的水浴鍋中加熱30 min，取出后冷卻至室溫，在加入2 mL的BF3-甲醇溶液，振蕩混勻，在65 ℃水浴鍋中繼續(xù)加熱3 min，取出并自然冷卻后加入2 mL正己烷提取，同時加入2 mL飽和NaCl溶液水洗，取出上清液后在其中加入1/10體積無水硫酸鈉，取上清液用于氣相色譜分析。

1.3.4 氣相色譜條件

色譜柱：HP-88毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.2 μm）；載氣：高純氮氣；恒流：0.65 mL/min；進樣量：1 μL；分流比：40∶1；進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升至220 ℃維持15 min。

1.3.5 高效液相色譜條件

色譜柱：YMC Triart二醇基HILIC柱（4.6 mm×250 mm，3 μm）；流動相A：含有53 mmol/L甲酸的乙腈溶液（pH 4.0～4.5）；流動相B：含有60 mmol/L甲酸銨和53 mmol/L甲酸的溶液（pH 3.6）；流動相流速：200 μL/min。進樣量：10 μL；梯度洗脫程序：0～15 min，2% A；15～60 min，2%～40% A；60～70 min，40% A；70～80 min，40%～2% A。

1.3.6 質(zhì)譜條件

負離子模式檢測；掃描范圍：500～1 000 Da；去簇電壓1：50 V；聚焦電勢：200 V；離子源電壓：4 500 V；去簇電壓2：10 V；氣源1：50 psi；氣源2：45 psi；氣簾氣：40 psi；脫溶劑溫度：450 ℃；子離子掃描碰撞能：20 V。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采集與分析采用美國AB Sciex公司Analyst QS v2.0軟件。磷脂提取中對于實驗所得的6 組平行數(shù)據(jù)用Excel進行標準差分析，并用Origin軟件作圖。響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計中利用Design-Expert 8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析和響應(yīng)面繪制。高效液相色譜及質(zhì)譜分析中均使用歸一化法進行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷脂提取單因素試驗結(jié)果

圖1 乙醇體積分數(shù)對蝦頭磷脂提取的影響Fig. 1 Effect of ethanol concentration on the extraction of phospholipids from shrimp heads

由圖1可知，當乙醇體積分數(shù)由70%提高到90%時，蝦頭副產(chǎn)物中磷脂提取量隨著乙醇體積分數(shù)增大而增加，其原因可能是溶劑的極性與磷脂性質(zhì)趨于相似，進而提高了磷脂在溶劑中的溶解度。隨后蝦頭副產(chǎn)物中磷脂的提取量略有下降，當使用純乙醇時，磷脂的提取量下降顯著。因此，兼考慮提取效率與經(jīng)濟性，萃取溶劑為90%乙醇溶液是該因素的最優(yōu)條件。

圖2 提取溫度對蝦頭磷脂提取的影響Fig. 2 Effect of temperature on the extraction of phospholipids from shrimp heads

提取過程是固相液相之間的擴散過程，提取效率極易受溫度的影響。由圖2可見，蝦頭副產(chǎn)物中磷脂的提取量自20 ℃開始隨著溫度的升高而逐漸增加，50 ℃時提取量達到最大，升高溫度能提高分子的動能和擴散速率，促進溶劑滲入細胞組織間隙。當繼續(xù)升溫時提取量反而呈現(xiàn)下降趨勢，原因可能是過高的溫度會導(dǎo)致料液間出現(xiàn)氣化層，阻礙了分子運動，另一方面，磷脂溶于乙醇屬于放熱反應(yīng)，其溶解度隨著溫度升高有所降低。在工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用中，蝦頭副產(chǎn)物中磷脂的提取必須保持在一定的溫度范圍（45～50 ℃），使用溫控系統(tǒng)創(chuàng)造適宜和穩(wěn)定的溫度環(huán)境。

圖3 提取時間對蝦頭磷脂提取的影響Fig. 3 Effect of extraction time on the extraction of phospholipids from shrimp heads

由圖3可以看出，蝦頭副產(chǎn)物中磷脂的提取量隨著時間的延長而增大，將靜置時間從10 min延長至30 min磷脂提取量逐漸提高，隨后趨于平衡并略有下降。通常提取時間越長，磷脂溶出越充分，但時間過長易導(dǎo)致磷脂被磷脂酶分解以及磷脂氧化降解。實踐中考慮到效率問題，選用30 min提取時間有利于達到最經(jīng)濟的效果。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

利用Design-Expert 8.0軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到相應(yīng)的二次響應(yīng)面回歸方程：Y=11.60+0.063A-0.050B+0.063C+0.17AB-0.20AC+0.13BC-0.35A2-0.83B2-0.50C2。

以磷脂提取量為響應(yīng)值進行二次多元回歸擬合，對回歸方程模型各項系數(shù)進行方差分析，分析結(jié)果見表3。由表3可知，模型P值小于0.000 1，回歸模型極顯著（P＜0.01）。失擬項P值為0.198 5大于0.05，不顯著。此方程R2值為0.983 9，即響應(yīng)值的變化有98.39%與所選變量有關(guān)，說明該回歸方程與實際數(shù)據(jù)擬合度較高。此二次模型成立，該模型可以有效擬合3 個因素與磷脂提取量?？梢钥闯鲆掖俭w積分數(shù)和提取時間對磷脂提取量影響顯著，并且3 個因素的交互影響均顯著，說明3 個因素之間的交互作用可以顯著地影響磷脂提取量。

表3 回歸方程參數(shù)方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

圖4 各因素交互影響的等高線及響應(yīng)面圖Fig. 4 Response surface and corresponding contour plots

由圖4可知，因素A（乙醇體積分數(shù)）和因素C（提取時間）的響應(yīng)面曲線坡度較大，表明這二者對磷脂提取量的影響較為顯著；因素B（提取溫度）曲線則較為平滑，說明提取溫度對磷脂提取量的影響相對較小，這與回歸模型方差分析中的結(jié)果一致。

通過Design-Expert 8.0軟件對響應(yīng)面進行最優(yōu)化分析后得出最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)90.35%、提取溫度49.81 ℃、提取時間30.47 min，提取量預(yù)測值為11.60 mg/g。考慮到實際的操作條件，將提取條件調(diào)整為乙醇體積分數(shù)90%、提取溫度50 ℃、提取時間30 min。在最佳條件下進行5 次重復(fù)實驗，驗證得到磷脂的實際提取量平均值為（11.58±0.03）mg/g，與優(yōu)化前的（6.30±0.52）mg/g相比提高了83.8%，此優(yōu)化條件有效。使用該方法提取磷脂，提取量略低于經(jīng)典的氯仿-甲醇法[21,23]，但方法安全性高，更適用于食品加工工業(yè)。

2.3 色譜條件優(yōu)化結(jié)果

圖5 高效液相色譜流動相條件優(yōu)化Fig. 5 Optimization of the mobile phase in high performance liquid chromatography

由圖5A可見，磷脂標準品在二醇基HILIC柱上分離度不佳，多數(shù)峰在保留時間10～20 min區(qū)間內(nèi)重疊效應(yīng)較為嚴重，僅有PS分離度尚可，在保留時間28.38 min時可見峰形對稱尖銳的色譜峰。調(diào)節(jié)流動相的pH值，向流動相A中加入53 mmol/L甲酸（pH 4.0～4.5），向流動相B中加入60 mmol/L的甲酸銨和53 mmol/L甲酸（pH 3.6），再次對磷脂標準品分離，結(jié)果如圖5B所示，各個色譜峰分離度均較佳，峰形獨立對稱，該流動相條件可用于下一步定性定量實驗。將本實驗方法應(yīng)用于蝦頭副產(chǎn)物中的磷脂提取物時，由于實驗樣品中成分較為復(fù)雜，雜質(zhì)峰較多，得益于較好的色譜分離條件，目標磷脂化合物依然清晰可辨，在選定條件下得到的樣品色譜分離如圖5C所示。

2.4 脂肪酸鏈組成分析

本實驗對提取所得磷脂樣品進行甲酯化后，利用氣相色譜法測定磷脂的脂肪酸鏈化學(xué)組分，并用面積歸一法確定各脂肪酸的相對含量。通過對磷脂樣品中化學(xué)成分氣相色譜圖與37 種脂肪酸甲酯混合標準品氣相色譜圖的對比，可得到表4。結(jié)果顯示，磷脂樣品中共包含23 種不同的脂肪酸鏈，其中飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）鏈占39.66%，單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）鏈占9.51%，多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）鏈占35.33%。SFA鏈中，以棕櫚酸鏈、硬脂酸鏈和十七烷酸鏈為主要組成成分，其相對含量分別為27.70%、8.20%和2.20%；MUFA鏈中，以油酸鏈、棕櫚油酸鏈和花生一烯酸鏈為主要組成成分，其相對含量分別為3.06%、2.97%和2.26%；PUFA鏈中，以亞油酸鏈、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）鏈和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）鏈為主要組成成分，其相對含量分別為16.16%、8.56%和3.65%。由該方法所提取的蝦頭副產(chǎn)物磷脂的脂肪酸鏈中，多數(shù)為不飽和脂肪酸鏈，這其中大部分為PUFA鏈。該結(jié)果與Shen Qing等[7]對蝦副產(chǎn)物進行磷脂提取時所得結(jié)果基本類似。

表4 蝦頭副產(chǎn)物磷脂的脂肪酸鏈化學(xué)組分及相對含量Table 4 Relative contents of fatty acyl chains of phospholipids from shrimp heads

2.5 脂質(zhì)組學(xué)分析

對比圖5B和圖5C可知磷脂樣品中所含的磷脂種類。因磷脂酰甘油（phosphatidyl glycerol，PG）一般不存在于動物骨骼肌組織中，甘油磷脂酸（phosphatidic acid，PA）在蝦類組織中屬低豐度磷脂，故這2 類磷脂在本實驗中均未檢出[31]。標準品中PC的出峰時間為19.98 min（圖5B），對比可得，樣品中20.02 min的峰即為PC（圖5C）。同理，圖5C中出峰時間為22.11 min的峰為PI，出峰時間為50.73 min的峰為PE，出峰時間為51.35 min的峰為PS。繼而可得到每類磷脂分子所包含的分子種類（圖6）。

由圖6可知，該磷脂樣品中，PC和PS兩類磷脂分子檢測圖譜出峰較多，PE類磷脂分子檢測圖譜出峰次之，PI類磷脂分子檢測圖譜出峰為4類中最少。其中，PC類m/z多集中在824.6～876.7，m/z 850.6、m/z 852.7等峰豐度較大；PE類m/z多集中在748.6～774.6，m/z 774.6、m/z 748.6等峰豐度較大；PI類m/z多集中在855.6～885.6，m/z 883.6、m/z 885.6等峰豐度較大；PS類m/z多集中在750.6～830.7，m/z 778.6、m/z 750.6等峰豐度較大。

圖6 磷脂樣品質(zhì)譜圖Fig. 6 Mass spectra of phospholipids

待磷脂分子種類確定后，本實驗先用多維質(zhì)譜法得到所有含有選定脂肪酸鏈碎片的磷脂，與圖6進行對比后由LipidViewTM軟件定性和多維質(zhì)譜解析，并通過歸一化法對已鑒定的磷脂分子進行相對含量測定，結(jié)果見表5。實驗表明，提取所得磷脂樣品中共檢測出10 種PC、6 種PE、4 種PI、8 種PS。其中，磷脂的C原子總數(shù)為34～40，雙鍵數(shù)為1～8。在這4類磷脂中，PC中38∶6（38.52%）、38∶5（20.71%）、36∶2（8.54%）等分子種含量較高；PE中O-40∶7（52.32%）、O-38∶6（20.31%）、O-38∶5（10.22%）等分子種較高；PI中38∶5（31.32%）、38∶4（15.69%）、36∶5（7.88%）等分子種含量較高；PS中36∶6（28.74%）、34∶6（13.65%）、36∶7（6.24%）等分子種含量較高。由表5還可看出，該提取方法所得各種類磷脂的脂肪酸鏈中存在許多不飽和度較高的脂肪酸鏈，如PC中有38∶7、40∶7、O-38∶6、38∶6、40∶6、36∶5、O-38∶5、38∶5等分子種；PE中有38∶7、O-40∶7、O-38∶6、38∶6、O-38∶5等分子種；PI中有36∶5、38∶5等分子種；PS中有40∶8、36∶7、38∶7、40∶7、34∶6、O-36∶6、36∶6、40∶6等分子種。

表5 蝦頭副產(chǎn)物中磷脂分子結(jié)構(gòu)與含量Table 5 Molecular structures and contents of phospholipids in shrimp heads

經(jīng)脂質(zhì)組學(xué)定性定量分析，該提取方法共從蝦頭中提取得到PC、PE、PI、PS四類磷脂分子，與其他方法提取所得相似。同時，各類磷脂分子又共計得到28 種分子種，較經(jīng)典氯仿-甲醇法略少[7,23]。

3 結(jié) 論

目前磷脂的提取方法中多采用氯仿或二氯甲烷等不適用于食品工業(yè)的溶劑進行提取，本方法則采用了乙醇浸提法，并對其進行優(yōu)化，得到最佳實驗條件為體積分數(shù)90%乙醇溶液在50 ℃條件下提取30 min，實際提取量平均值為（11.58±0.03）mg/g，與優(yōu)化前的（6.30±0.52）mg/g相比提高了83.8%。通過對該方法提取所得磷脂樣品進行脂肪酸鏈分析和脂質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蝦頭副產(chǎn)物中磷脂的脂肪酸鏈主要含有棕櫚酸鏈、亞油酸鏈、EPA鏈和硬脂酸鏈等23 種脂肪酸鏈，其中MUFA鏈占9.51%，PUFA鏈占35.33%；共檢測出10 種PC、6 種PE、4 種PI、8 種PS，且磷脂的不飽和脂肪酸鏈比例較高。該方法安全性高，適用于食品工業(yè)生產(chǎn)，并很好地優(yōu)化了對于蝦頭副產(chǎn)物的利用，不僅為磷脂提取提供了新途徑，還在很大程度上達到了保護生態(tài)環(huán)境的目的。