王郅媛，姚 婷，范雅為，張 燕，王友升,*

（1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學(xué)，北京 100048；2.北京科學(xué)儀器裝備協(xié)作服務(wù)中心，北京 100035）

華萊士瓜（Cucumis melo cv. Hetau）屬于葫蘆科（Cutrbitaceae）甜瓜屬（Cucumis）的厚皮甜瓜（C. melo L.），又稱蜜瓜[1]，產(chǎn)于內(nèi)蒙古河套地區(qū)。華萊士瓜外表呈圓形或檸檬形，間有裂紋，分桔紅、橙黃和青麻綠3 種皮色，瓜瓤呈純白、綠白和翠綠色。其味獨(dú)特，清爽芳香，且營養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛。但因其含水量和含糖量高，生理代謝旺盛，易受病原菌侵染[1-2]。蔣賢權(quán)等[3]對(duì)甜瓜采后病原菌進(jìn)行研究，甜瓜采后病害已發(fā)現(xiàn)20 余種。據(jù)報(bào)道，甜瓜病原真菌主要有鏈格孢菌（Alternaria）、鐮刀菌（Fusarium）、青霉菌（Penicillium）等，比較常見的還有白地霉病菌（Geotrichum candidum）、莖點(diǎn)霉病菌（Phomopsis archerinom）和赤霉（Gibberella）等[4-7]。王志田等[8]發(fā)現(xiàn)引起哈密地區(qū)甜瓜軟腐病、紅粉病、白霉病、黑斑病和青霉病的病原菌分別是毛霉菌（Mucor mucedo）、紅粉病菌（C. roseum）、鐮刀菌、鏈格孢菌和青霉。然而，目前鮮見引起華萊士瓜采后病害病原真菌的相關(guān)報(bào)道。

利用rDNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）的可變區(qū)分化程度高、變異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可通過分析較短的rDNA ITS區(qū)序列信息，快速有效地從分子水平上解決真菌分類鑒定及進(jìn)化水平上的差異性問題[9-12]。雖然對(duì)由真菌引起的甜瓜病害研究較多，但目前尚鮮見利用rDNA ITS區(qū)序列分析技術(shù)系統(tǒng)研究有關(guān)河套地區(qū)華萊士瓜病原真菌的報(bào)道，也少見引起甜瓜病害菌屬內(nèi)種間的分類報(bào)道。

本研究從采后貯藏期間的華萊士瓜上分離到12 株絲狀真菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)和rDNA ITS區(qū)序列分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了引起華萊士瓜采后病害的新病原微生物，以期進(jìn)一步豐富華萊士瓜采后病原微生物種類，為華萊士瓜采后病害的生物防治提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

從采后貯藏期間自然發(fā)病的“華萊士瓜”果實(shí)表面分離到12 株絲狀真菌，經(jīng)純化后命名為菌株348#、351#、353#、357#、358#、360#、361#、362#、364#、378#、379#、380#。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥芽浸粉（ME）培養(yǎng)基：瓊脂18 g、麥芽浸粉20 g，調(diào)節(jié)pH值至5.5±0.2，在高溫高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯（PDA）培養(yǎng)基：稱取200 g馬鈴薯切片，加入1 L無菌水，用電池爐煮沸30 min后，取濾液，向?yàn)V液中加入葡萄糖20 g、瓊脂18 g，最后加水補(bǔ)足至1 L，在高溫高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

通用引物ITS-4和ITS-5由美國英杰（Invitrogen）生命技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)合成；DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2×Taq PCR Mix、Marker VII、6×Loading Buffer（溴酚藍(lán)）天根生化試劑公司；三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸鈉 美國Amersco公司；乙醇、鹽酸均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CJ100凈化試驗(yàn)臺(tái) 北京賽伯樂實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HQ45恒溫?fù)u床、MJX-250 II霉菌培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；Imager 2200凝膠成像系統(tǒng) 美國Alpha公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Bio-Rad公司；冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；Axio Image A1顯微鏡 德國Zeiss公司；生物安全柜 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的分離、純化與回接[13]

分離：取華萊士瓜果實(shí)的病害、健康交界處組織于PDA固體培養(yǎng)基平板上，25 ℃培養(yǎng)3 d。純化：取分離菌邊緣菌塊，分別三點(diǎn)轉(zhuǎn)接到PDA和ME培養(yǎng)基平板上，于25 ℃培養(yǎng)14 d，觀察7 d和14 d菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)特征?；亟樱禾暨x健康無損傷的華萊士瓜，75%乙醇溶液表面消毒，用無菌接種針刺孔，取純化后的菌塊接種至傷口處，觀察果實(shí)接種處的病癥。

1.3.2 形態(tài)學(xué)觀察

將純化得到生長于PDA培養(yǎng)基上的菌落，從菌落外沿取菌塊，分別三點(diǎn)轉(zhuǎn)接到PDA和ME培養(yǎng)基平板上，于25 ℃條件下培養(yǎng)14 d，分別觀察菌落形態(tài)。于潔凈載玻片上，滴1滴乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液[14]，將插片培養(yǎng)的蓋玻片置染色液中，然后蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察產(chǎn)生分生孢子及分生孢子梗的形狀、色澤和分生孢子隔膜等性狀。

1.3.3 基因組DNA的提取及ITS區(qū)PCR擴(kuò)增與測序

基因組DNA的提取：采用改良后十二烷基硫酸鈉-氯化芐法提取待鑒定菌株的基因組DNA[11]作為PCR模板。

ITS區(qū)PCR擴(kuò)增：以真菌rDNA ITS區(qū)的通用引物ITS-4和ITS-5作為PCR擴(kuò)增引物，擴(kuò)增12 株菌的ITS區(qū)序列。

1.4 數(shù)據(jù)分析

PCR產(chǎn)物由北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行脫鹽、純化和雙向測序，測序結(jié)果在CExpress軟件中進(jìn)行序列拼接，將拼接結(jié)果在網(wǎng)站https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上進(jìn)行核酸比對(duì)[9]，根據(jù)比對(duì)結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中尋找目的菌株同源序列，通過MEGA6軟件進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與回接結(jié)果

從采后貯藏期間自然發(fā)病的華萊士瓜上分離到12 株絲狀真菌（圖1a～l），純化后回接到健康無傷的相應(yīng)品種華萊士瓜上，在接種部位均出現(xiàn)相同的病癥（圖1A～L），并能從該病害部位再次分離得到相應(yīng)病原菌，因此，可確定上述12 種絲狀真菌均為華萊士瓜致病菌。

圖1 12 株絲狀真菌分離與回接病癥Fig. 1 Symptoms of infected and reinoculated fruits with twelve strains of fi lamentous fungi

2.2 病原菌的形態(tài)觀察

2.2.1 菌落形態(tài)

圖2 12 株華萊士瓜采后絲狀病原真菌分別在PDA（a～l）和ME培養(yǎng)基（A～L）上25 ℃培養(yǎng)7 d和14 d的菌落特征Fig. 2 Colony growth of twelve strains of fi lamentous fungi cultured on ME and PDA plates at 25 ℃ for 7 or 14 d

由圖2可知，12 株絲狀真菌在PDA培養(yǎng)基上長勢均很旺盛，7 d時(shí)基本長滿板。在ME培養(yǎng)基上351#和378#長勢較其他10 株菌弱，14 d時(shí)還未長滿板，而其他菌株7 d時(shí)基本鋪滿板。其中，菌株348#在PDA和ME培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后的菌落形態(tài)一致，菌落質(zhì)地緊密且菌絲較長呈白色絨毛狀，培養(yǎng)14 d后菌絲變得更加緊密并分布在板上的面積增大（圖2a1、A1和圖2a2、A2）；菌株351#在PDA培養(yǎng)基上7 d后近滿板，菌落質(zhì)地緊密且菌絲較短，圓心周圍是綠色外延菌絲呈白色，而在ME培養(yǎng)基不到1/2板、淺綠色，14 d后分布在板上的面積均增大，在PDA培養(yǎng)基上菌絲顏色變?yōu)榛疑?，在ME培養(yǎng)基上菌絲綠色加深（圖2b1、B1和圖2b2、B2）。菌株353#在兩種培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后都接近長滿板，但在PDA培養(yǎng)基生長較快，菌落質(zhì)地緊密且菌絲較長呈雪白色，14 d后分布在板上的面積均增大、菌絲顏色變黃，但在PDA培養(yǎng)基上更明顯的變?yōu)槌赛S色（圖2c1、C1和圖2c2、C2）；菌株357#在PDA和ME培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后菌落質(zhì)地緊密且菌絲較長，呈天鵝絨狀，PDA培養(yǎng)基上菌絲呈酒紅褐色，而ME培養(yǎng)基上菌絲呈半透明的白色，14 d后菌絲顏色均加深并分布在板上的面積增大（圖2d1、D1和圖2d2、D2）；菌株358#在PDA和ME培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，長滿板，菌落形態(tài)一致，菌落質(zhì)地緊密且菌絲較短，PDA培養(yǎng)基上菌絲略有黃色分泌物，14 d后，菌絲顏色均加深略有變黃并分布在板上的面積增大（圖2e1、E1和圖2e2、E2）；菌株360#在PDA和ME培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后近滿板，菌落形態(tài)一致，菌落質(zhì)地緊密且菌絲較短，整體呈黑色，但在PDA上生長較ME培養(yǎng)基上快且顏色更深，14 d后，菌絲顏色均加深并分布在板上的面積增大（圖2f1、F1和圖2f2、F2）；菌株361#在PDA和ME培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，長滿板，菌落形態(tài)一致，菌落質(zhì)地緊密且菌絲較短，整體呈深綠色，14 d后，無明顯變化（圖2g1、G1和圖2g2、G2）；菌株362#在PDA和ME培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，近滿板，菌落質(zhì)地緊密且菌絲較長，在PDA板上呈乳白色而在ME板上呈半透明的白色，14 d后，無明顯變化（圖2h1、H1和圖2h2、H2）；菌株364#在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，上菌落質(zhì)地松散，外觀干燥，不透明，呈絨毛狀，而在ME培養(yǎng)基上的菌落直徑較大質(zhì)地緊密緊貼培養(yǎng)基表層，中心為白色絲狀菌絲圈，14 d后菌落向培養(yǎng)基周圍均勻伸展，ME培養(yǎng)基顏色加深（圖2i1、I1和圖2i2、I2）；菌株378#培養(yǎng)7 d后，在PDA培養(yǎng)基上長滿板且中間出現(xiàn)灰褐色凸起，邊緣清晰，菌絲呈白色絨毛狀；在ME培養(yǎng)基上長滿2/3板，14 d后，在兩種培養(yǎng)基上，菌絲顏色均加深并分布在板上的面積增大（圖2j1、J1和圖2j2、J2）。菌株379#培養(yǎng)7 d后，菌落圓形，質(zhì)地緊密，外觀干燥，不透明，呈絨毛狀，菌絲滲透在培養(yǎng)基表面淺層，整體呈灰綠色，中央灰褐色，14 d后，菌落轉(zhuǎn)為灰褐色，長滿板（圖2k1、K1和圖2k2、K2）。菌株380#生長較慢，在PDA培養(yǎng)基和ME培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后菌絲均長到2/3平板，PDA培養(yǎng)基上菌落呈粉紅色絨毛狀，ME培養(yǎng)基上菌落質(zhì)地緊密白色絨毛狀，而14 d后菌絲顏色均加深并分布在板上的面積增大（圖2l1、L1和圖2l2、L2）。

2.2.2 顯微形態(tài)

圖3 12 株絲狀真菌的顯微形態(tài)觀察Fig. 3 Morphological characteristics of twelve strains of fi lamentous fungi

由圖3個(gè)體形態(tài)觀察結(jié)果表明，在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)14 d，12 株菌的顯微形態(tài)各異。菌株348#在PDA培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢，菌絲著色較淺，分枝多且內(nèi)部隔膜觀察不明顯（圖3a、A）。菌株351#菌絲著色較深，分枝多且內(nèi)部隔膜觀察明顯；分生孢子呈倒棒狀，頂端延長呈喙?fàn)?，淡褐色，有壁磚狀分隔，暗褐色，成鏈生長，孢子的形態(tài)及大小規(guī)律（圖3b、B）。菌株353#菌絲著色較淺，分枝多且內(nèi)部隔膜觀察不明顯，分生孢子梗從菌絲垂直生出，頂端生排列成角狀的間枝（圖3c、C）。菌株357#在PDA培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢，菌絲著色較淺，分枝多且內(nèi)部隔膜觀察明顯（圖3d、D）。菌株358#菌絲著色淺，有隔膜，分生孢子球形，呈串珠狀，有瘤狀凸起或有褶紋（圖3e、E）。菌株360#菌絲著色較深，分枝多且內(nèi)部隔膜觀察明顯，孢子梗直立，無隔，頂端膨大形成頂囊，分生孢子卵圓形，密生于頂囊之上（圖3f、F）。菌株361#菌絲著色較淺，內(nèi)部隔膜觀察不明顯，頂端生排列成帚狀的間枝，分生孢子梗從菌絲垂直生出，有橫隔，單個(gè)孢子球狀、卵圓形或橢圓形（圖3g、G）。菌株362#菌絲著色較淺，分枝多且內(nèi)部隔膜觀察明顯，單個(gè)孢子橢球狀（圖3h、H）。菌株364#菌絲分枝較多且內(nèi)部無隔膜，不產(chǎn)孢（圖3i、I）。菌株378#菌絲著色較淺，分枝多且內(nèi)部隔膜觀察明顯；分生孢子梗直立，分枝或不分枝，淡褐色至綠褐色，有屈曲，分生孢子形成孢子鏈，孢子有喙或無喙橢圓形表面光滑，淡欖褐色至深欖褐色，有橫膈膜或縱橫隔膜（圖3j、J）。菌株379#菌絲著色較深，分生孢子單孢呈橢圓形（圖3k、K）。菌株380#PDA培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢，菌絲著色較淺，分枝多且內(nèi)部隔膜觀察明顯（圖3l、L）。

將上述12 株絲狀真菌的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)的結(jié)果與文獻(xiàn)[15]對(duì)絲狀真菌菌落、菌絲和孢子的描述進(jìn)行比較，菌株348#、353#、357#、364#和380#與鐮刀屬（Fusarium LK. ex Fr.）真菌形態(tài)一致，菌株351#和378#與鏈格孢屬（Alternaria Nees ex Wallr.）真菌形態(tài)一致；菌株360#、362#和379#與曲霉屬（Aspergillus Micheli ex Fr.）真菌形態(tài)一致，菌株358#與附球菌屬（Epicoccum LK. Ex Wallr.）真菌形態(tài)一致，菌株361#與青霉屬（Penicillium LK. ex Fries.）真菌形態(tài)一致。

2.3 構(gòu)建ITS區(qū)rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖4 以rDNA ITS基因序列為分子標(biāo)記的華萊士瓜病原菌菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4 Positions of twelve strains in the phylogenetic tree built based on ITS rDNA sequence

將12 株華萊士瓜病原菌菌株的rDNA ITS測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索相似度達(dá)97%以上的同源序列，通過MEGA6軟件Bootstraps功能計(jì)算目的菌株所在進(jìn)化樹各分枝的置信度，發(fā)現(xiàn)12 株病原真菌分別屬于5 個(gè)不同的屬，菌株348#、353#、357#、364#和380#為鐮刀屬真菌，其中348#和353#鑒定為木賊鐮刀菌（F. equiseti），357#和364#鑒定為輪狀鐮刀菌（F. verticillioides），380#鑒定為燕麥鐮刀菌（F. avenaceum）；菌株351#和378#分別為鏈格孢屬的互交鏈格孢菌（A. alternata）和細(xì)極鏈格孢菌（A. tenuissima）；360#、362#和379#鑒定為曲霉屬真菌，其中360#鑒定泡盛曲霉菌（A. awamori），362#和379#為黑曲霉菌（A. niger）；而菌株358#和361#則分別為黑附球菌（E. nigrum）和草酸青霉菌（P. oxalicum）（圖4）。

3 討 論

微生物可分為細(xì)菌（原核生物）和真菌（包括酵母和霉菌，原核生物），不同微生物有不同的生存及繁殖方式；其中霉菌可以根據(jù)菌落形態(tài)，菌絲特征、是否產(chǎn)孢及孢子形態(tài)分為曲霉、灰霉和青霉等不同類別。而rDNA ITS區(qū)由于同時(shí)存在保守區(qū)和可變區(qū)，用于真菌鑒定既體現(xiàn)了進(jìn)化過程中的遺傳性的同時(shí)也體現(xiàn)了變異性，保守性強(qiáng)且變異有長度和序列的多態(tài)性，因此被廣泛用于菌株鑒定。姚婷[16]和黃津津[17]等結(jié)合形態(tài)學(xué)和rDNA ITS區(qū)序列的結(jié)果，分別對(duì)櫻桃果實(shí)上分離到的5 株病原菌和葡萄上分離到的10 株病原菌進(jìn)行分類及鑒定。

本研究從華萊士瓜中分離的12 株病原菌大多數(shù)屬于鐮刀屬、鏈格孢屬和曲霉屬的病原菌。據(jù)報(bào)道，粉紅聚端孢霉（Cephalothecium roseum）和鐮刀菌（Fusarium）是蘭州甜瓜郁金香采后腐爛病的寄生性病原菌，而黑曲霉（A. nige）和青霉（Penicillium）是其腐生性病原菌[18]。梁寧等[19]從新疆哈密瓜上分離出Alternaria（50%）、Fusarium（20%）、Rhizopm（12%）、Colletotrichum（8%）、Trichothecium（5%）、Penicillium（1%～2%）、Botryt cinerea（1%～2%）7 個(gè)屬病原真菌，其中鏈格孢菌（Alternaria）和鐮刀菌（Fusarium）為哈密瓜采后優(yōu)勢致病菌，且易在高溫下致??；婁愷等[20]也發(fā)現(xiàn)交鏈孢霉和鐮刀菌是哈密瓜卡拉克賽的采后優(yōu)勢致腐病原菌。

本研究從采后貯藏期間華萊士瓜上分離到2 株鏈格孢屬真菌，菌株351#為互交鏈格孢霉菌（A. alternata）與張輝等[21]報(bào)道一致，菌株378#為細(xì)極鏈格孢菌（A. tenuissima），該菌還可侵染棗、黑果梨和藍(lán)莓[22-23]。類似的，本研究分離到的3 株曲霉屬菌，該屬真菌還可導(dǎo)致葡萄、石榴和蘋果等果實(shí)腐爛[24-26]，其中362#為黑曲霉菌（A. niger）這與李敏權(quán)等[3]報(bào)道一致，而菌株360#泡盛曲霉（A. awamori）為甜瓜上分離到曲霉屬的新病原菌。國內(nèi)外關(guān)于甜瓜鐮刀菌侵染甜瓜的報(bào)道未作系統(tǒng)分類[27-29]，而本研究從華萊士瓜上分離的5 株鐮刀屬菌，分別為348#和353#木賊鐮刀菌（F. equiseti）、357#和364#輪狀鐮刀菌（F. verticillioides）、380#燕麥鐮刀菌（F. avenaceum），均鮮見在甜瓜上分離到的報(bào)道。此外，從華萊士瓜上分離到的草酸青霉（P. oxalicum）是甜瓜上分離到青霉屬的新種；黑附球菌（E. nigrum）可侵染采后脫水干癟的葡萄果實(shí)[30]，也可作為拮抗菌防治桃果實(shí)的褐腐病菌[31]，但鮮見黑附球菌侵染華萊士瓜的相關(guān)報(bào)道。

4 結(jié) 論

從華萊士瓜上分離得到的12 株病原真菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及rDNA ITS區(qū)序列進(jìn)化樹分析鑒定為黑附球菌（E. nigrum）、草酸青霉（P. oxalicum）以及鏈格孢屬（Alternaria Nees ex Wallr.）、曲霉屬（Aspergillus Micheli ex Fr.）和鐮刀菌屬（Fusarium LK. ex Fr.）真菌。

首次關(guān)于細(xì)極鏈格孢菌（A. tenuissima）、泡盛曲霉（A. awamori）、木賊鐮刀菌（F. equiseti）、輪狀鐮刀菌（F. verticillioides）、燕麥鐮刀菌（F. avenaceum）和草酸青霉菌（P. oxalicum）在華萊士瓜上得到分離；黑附球菌（E. nigrum）為甜瓜采后貯藏期間首次分離到的病原真菌。