李 楊，鄒曉霜，李佳妮，李 紅，齊寶坤，王中江，江連洲，隋曉楠*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）由豆粕低溫提取，富含多種必需氨基酸并具有特定的空間結(jié)構(gòu)，是一種安全可靠又經(jīng)濟(jì)實用的蛋白資源，其氨基酸分?jǐn)?shù)近乎等同于動物蛋白，還可滿足乳糖不耐癥患者的需求[1-2]，能取代動物蛋白[3]，但SPI的加工特性還不能滿足現(xiàn)代工業(yè)的需求[4]。目前除傳統(tǒng)物理、化學(xué)、生物改性外，利用酚類來改善蛋白質(zhì)的加工特性是一個全新的領(lǐng)域[5]。

研究表明，在一定條件下蛋白質(zhì)可以與酚類物質(zhì)發(fā)生相互作用形成相對穩(wěn)定的衍生物[6-7]。食品工業(yè)中，產(chǎn)品研發(fā)和加工制造的核心研究目的是提高食品的營養(yǎng)和功能品質(zhì)，向原食物組分中加入酚類物質(zhì)，既可提高產(chǎn)品營養(yǎng)性、豐富性[8]，還在一定程度上提高蛋白的加工特性以及改善生物學(xué)活性[9]，但酚類物質(zhì)都不可避免地會與蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生相互作用[10]。其中，花青素是一種黃酮類純天然活性物質(zhì)，由于具有抗氧化、抗炎等生物活性被廣泛應(yīng)用于保健、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[11-12]。目前，國內(nèi)外對于蛋白與酚類互作的研究主要局限在非共價復(fù)合，Asquith等[13]發(fā)現(xiàn)多酚與蛋白的結(jié)合能力與種類有關(guān)。劉勤勤等[4]研究了茶多酚與SPI的相互作用。姚惠芳等[14]研究了篤斯越橘花青素與牛血清白蛋白的相互作用；對于共價復(fù)合的研究相對較少，Tantoush等[15]發(fā)現(xiàn)β-乳球蛋白與酸櫻桃酚共價復(fù)合后致敏性降低。Prodpran等[7]發(fā)現(xiàn)魚肌原纖維蛋白與多種酚類共價復(fù)合后，蛋白加工特性增強(qiáng)。Rawel等[16]發(fā)現(xiàn)大豆球蛋白與多種酚類共價復(fù)合后，蛋白質(zhì)溶解性改變，等電點(diǎn)偏移。目前國內(nèi)對于花青素與蛋白的非共價相互作用已經(jīng)進(jìn)行了一些報道，但對于花青素與SPI共價相互作用的機(jī)理研究尚存空白。

針對上述問題，本實驗探究了在堿性條件下不同質(zhì)量濃度花青素與SPI互作，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、熒光光譜、圓二色光譜等對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并建立以脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的Raw264.7體外細(xì)胞炎癥模型，通過對腫瘤壞死因子TNF-α以及NO的分泌量，測定SPI對花青素抗炎能力的影響。本研究為花青素與SPI共價相互作用的研究提供了理論方法和指導(dǎo)意義，并為進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆 市售；黑米提取物 中國山西天之潤生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒 中國Solarbio公司；乙腈、甲酸（均為色譜純）、LPS 美國Sigma-Aldrich公司；RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞 中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心；3 kDa超濾離心管 美國Millipore公司；Griess試劑 中國碧云天生物技術(shù)有限公司；TNF-α ELISA試劑盒 中國上海哈靈生物科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液 美國Gibco BRL公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

F-4500型熒光分光光度計 日本Hitachi公司；W A T 0 2 3 6 3 5高效液相色譜儀、C18反向色譜柱（250 mm×4.6 mm，2.5 μm） 美國Waters公司；GL-25MS超速高速冷凍離心機(jī) 上海盛析儀器設(shè)備有限公司；J-810圓二色光譜儀 日本Jasco公司；SPCH-10超高壓納米均質(zhì)機(jī) 安盛聯(lián)合科技有限公司；PHS-25型酸度計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；BSM電子分析天平 上海亭衡衡器有限公司；JJ-1電動攪拌器金壇市天竟實驗儀器廠；KDN-04B消化爐 上海昕瑞有限公司；RE201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 中浮儀器設(shè)備有限公司；RVC 2-18真空離心濃縮儀 德國Christ公司；FD5-3型冷凍干燥機(jī) 美國SIM公司；ULTRATURRAXUTL 2000乳化機(jī) 德國IKA公司；Tecan M200 PRO多功能酶標(biāo)儀 瑞士帝肯公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

參考Torrezan等[17]的方法，用粉碎機(jī)將大豆粉碎后過60 目篩網(wǎng)，按1∶3（g/mL）用正己烷脫脂豆粉3次。脫脂豆粉置入通風(fēng)櫥中12 h除去正己烷。將脫脂豆粉溶解于去離子水中，用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至9.0并充分?jǐn)嚢瑁? ℃、14 000×g離心20 min取上清液，用2 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至4.5，4 ℃、4 000×g離心20 min棄去上清液，將沉淀用去離子水充分水洗3 次后，用2 mol/L的NaOH溶液將溶液pH值調(diào)至7.0。樣品經(jīng)-40 ℃預(yù)凍24 h后冷凍干燥，研磨后得到SPI（根據(jù)GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（90.5±0.30）%）。

1.3.2 黑米提取物中花青素的提純及主要成分的鑒定

花青素的提純參考Sui Xiaonan等[18]的方法，稱取10 g黑米提取物，將黑米提取物與去離子水按1∶10（g/mL）配制成混合液后進(jìn)行減壓抽濾。將濾液進(jìn)行固相萃取分別依次加入0.01 mol/L的HCl-乙酸乙酯-甲醇（5∶4∶4，V/V），最后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除甲醇得到花青素提純樣品。

花青素主要成分的鑒定，取50 μL溶于甲醇的花青素樣品于EP管中，用真空濃縮儀除去甲醇后加入50 μL去離子水經(jīng)振蕩器混勻，取20 μL樣液稀釋至10 mL并過0.45 μm濾膜，單次進(jìn)樣量50 μL，流速1 mL/min，流動相A為5%甲酸，流動相B為100%乙腈，梯度0～5 min流動相A為100%，流動相B為0%；20 min流動相A為90%，流動相B為10%；40 min流動相A為87%，流動相B為13%；44 min流動相A為80%，流動相B為20%；50 min時流動相A為75%，流動相B為25%，55 min時流動相A為0%，流動相B為100%。柱溫25℃，檢測器波長520 nm。

最終檢測結(jié)果黑米提取物中花青素主要成分為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，根據(jù)擬合曲線計算最終純度為（89.40±0.02）%，可認(rèn)為純品，相對分子質(zhì)量按449.38計算。將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到的提純樣品溶于0.01 mol/L的HCl溶液中配制成50 mg/mL的花青素母液，于－20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 SPI與花青素的共價復(fù)合

參考Rawel等[19]的方法稍加修改，用去離子水配制質(zhì)量濃度為20 mg/mL的SPI溶液，500 r/min磁力攪拌2 h以確保蛋白充分溶解，分別加入50 mg/mL的花青素母液，調(diào)節(jié)溶液pH值至9.0后加入去離子水并定容使蛋白最終質(zhì)量濃度為10 mg/mL，并分別使花青素最終質(zhì)量濃度為1.000、0.500、0.250、0.167、0.125 mg/mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%疊氮化鈉防止微生物滋生，并在室溫下500 r/min磁力攪拌16 h，然后將部分樣品在4 000×g于3 kDa超濾離心管中離心20 min以除去游離花青素，凍干后用于結(jié)構(gòu)測定。其余樣品直接凍干，花青素對照組經(jīng)相同處理后凍干。

1.3.4 溶解度測定

參考Morr等[20]的方法，將樣品分散于10 mL的去離子水中，然后用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值（pH 2～10），500 r/min條件下磁力攪拌30 min，隨后4 ℃、14 000×g離心20 min。取上清液，采用微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)溶解度計算公式如下：

1.3.5 SDS-PAGE檢測

根據(jù)Liu Fuguo等[21]的方法稍加修改，將20 μL樣品稀釋于含有β-巰基乙醇的2×上樣緩沖液中，于95 ℃加熱90 s變性處理。分別配制12%和5%的分離膠與濃縮膠，上樣量為10 μL，電泳過程電壓恒定，濃縮膠電壓60 V，分離膠電壓120 V。染色劑為0.25 g/L考馬斯亮藍(lán)R-250（0.25 g考馬斯亮藍(lán)R-250、400 mL甲醇、70 mL冰乙酸定容至1 L），電極液為甘氨酸14.41 g、Tris 3.03 g、SDS 1.0 g定容至1 L，脫色液A為甲醇-冰乙酸-水（40∶7∶53，V/V），脫色液B為甲醇-冰乙酸-水（5∶7∶88，V/V）。

1.3.6 熒光光譜分析

根據(jù)王中江等[22]的方法，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）分別將樣品稀釋至0.2 mg/mL，在280 nm波長處激發(fā)，測定波長范圍為300～400 nm，掃描速率60 nm/s，激發(fā)條帶寬度10 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm，每組樣品重復(fù)測定3 次。

1.3.7 圓二色光譜

根據(jù)Rawel等[19]的方法。分別稱取一定量的樣品，溶于磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L pH 7.0）中，使得蛋白質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL，樣品池光程為1 mm，實驗溫度25 ℃，掃描速率100 nm/min，分辨率0.1 nm。采用CDpro曲線擬合軟件包分析復(fù)合物的二級結(jié)構(gòu)組成使用的參考蛋白為SMP56，取蛋白平均殘基摩爾質(zhì)量為115 g/mol，計算波長范圍為200～240 nm，每組樣品重復(fù)測定3 次。

1.3.8 體外Raw264.7炎癥細(xì)胞模型的建立

Raw264.7細(xì)胞采用DMEM完全培養(yǎng)基（10%的FBS、4 mmol/L的L-谷氨酰胺、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的鏈霉素）于25 cm2帶蓋透氣斜口培養(yǎng)瓶中，并在無菌培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2孵育；當(dāng)細(xì)胞融合至70%～80%時進(jìn)行傳代處理，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液沖洗后，加入DMEM培養(yǎng)基2 mL并用細(xì)胞刮刀將貼壁細(xì)胞刮落，以1∶2的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代，選取5 代后細(xì)胞用于實驗；使用無FBS、無雙抗的DMEM培養(yǎng)基溶解花青素以及花青素與未超濾SPI的復(fù)合物凍干樣。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到105個/mL時將細(xì)胞接種于24 孔平板中，在37 ℃、5% CO2無菌培養(yǎng)箱用不含F(xiàn)BS、雙抗的DMEM培養(yǎng)基饑餓處理24 h后，分別用花青素以及未超濾SPI-花青素的復(fù)合物孵育細(xì)胞4 h，最后以質(zhì)量濃度10 ng/mL的LPS孵育24 h。

1.3.9 MTT法檢測細(xì)胞活性

采用MTT法檢測花青素以及SPI-花青素復(fù)合物對RAW264.7細(xì)胞的增殖作用。取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，細(xì)胞密度達(dá)到5×104接種于96 孔細(xì)胞養(yǎng)板中，分別加入不同質(zhì)量濃度花青素以SPI-花青素的復(fù)合物，補(bǔ)充無FBS、無雙抗DMEM培養(yǎng)基至200 μL并使樣品最終質(zhì)量濃度為50、100、200 μg/mL，對照組加入無FBS、無雙抗DEME培養(yǎng)基。在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入MTT試劑20 μL，在培養(yǎng)箱中4 h后，每孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min后檢測570 nm波長的光密度，計算細(xì)胞活力。

1.3.10 TNF-α及NO含量的測定

Raw264.7細(xì)胞經(jīng)LPS處理24 h后，用無菌離心管收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心20 min，收集上清液，測定不同質(zhì)量濃度花青素以及SPI-花青素復(fù)合物處理Raw264.7細(xì)胞后TNF-α的分泌量，采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，具體操作按說明書進(jìn)行，以空白孔調(diào)零，450 nm波長處測定各孔OD值，每實驗組重復(fù)3 次。氮氧化物含量的測定，采用NO檢測試劑盒，具體操作按說明書進(jìn)行，540 nm波長處測定各孔OD值，每實驗組重復(fù)3 次[23]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

使用Statistics 8進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析和方差分析（P＜0.05為顯著性差異），若P值小于0.05，使用Duncan’s multiple range test進(jìn)行多重比較。采用Sigma Plot軟件進(jìn)行圖譜分析和圖表制作。每個實驗重復(fù)3 次，結(jié)果表示為 ±s。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合物溶解性的變化

圖1 花青素質(zhì)量濃度對SPI溶解性的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of anthocyanins on the solubility of SPI

食物組分中蛋白質(zhì)的溶解性與乳化性、凝膠性、持水性等加工特性息息相關(guān)。凱氏定氮法測定SPI與不同質(zhì)量濃度花青素復(fù)合后溶解度的變化情況（pH 2.0～10.0），如圖1所示，SPI的溶解度隨花青素質(zhì)量濃度增加呈下降趨勢，等電點(diǎn)略微向pH值增大方向偏移，且當(dāng)SPI與1.000 mg/mL質(zhì)量濃度的花青素復(fù)合時溶解度最低。SPI主要由球蛋白組成，這種蛋白質(zhì)分子極性集團(tuán)朝向外部，可以與極性的水分子相互作用[24]，當(dāng)加入花青素后，可能是由于在堿性條件下SPI的側(cè)鏈氨基酸極性集團(tuán)與花青素的酚羥基結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子體系極性下降，溶解度降低。Rawel等[16]曾研究過大豆球蛋白與多種酚類物質(zhì)堿性條件下共價復(fù)合，結(jié)果表明大豆蛋白溶解性的改變與所加入酚的種類有關(guān)。

2.2 SDS-PAGE分析

圖2 花青素質(zhì)量濃度對SPI亞基組成的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of anthocyanins on subunit composition of SPI

SDS-PAGE具有較高的靈敏度的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，可根據(jù)亞基的分子質(zhì)量在電泳的過程中呈梯度逐漸分開[25]。由圖2可以看出，隨著花青素質(zhì)量濃度的增加，分子質(zhì)量在63～75 kDa的亞基與20～35 kDa的亞基逐漸消失，并伴隨著超高分子質(zhì)量亞基的與色散帶的生成，花青素質(zhì)量濃度為1.000 mg/mL條帶現(xiàn)象最為明顯。Liu Fuguo等[26]研究乳鐵蛋白與綠原酸相互作用，會導(dǎo)致乳鐵蛋白亞基的分子質(zhì)量稍有增加的趨勢；Rawel等[16]對大豆球蛋白與綠原酸、咖啡酸、楊梅素、槲皮素在堿性條件下互作時均出現(xiàn)超大分子質(zhì)量亞基的生成。在Liu Fuguo[26]、與Rawel[16]等的實驗結(jié)果中未觀察到低分子質(zhì)量亞基的消耗，可能由于未進(jìn)行對酚類物質(zhì)添加質(zhì)量濃度進(jìn)行探究，由于花青素分子質(zhì)量遠(yuǎn)小于大豆蛋白，因此圖中高分子質(zhì)量亞基條帶的生成，可能是由于花青素與蛋白互作后，使蛋白質(zhì)不同亞基之間發(fā)生聚合形成大分子亞基，而非花青素與亞基結(jié)合所產(chǎn)生。

2.3 熒光分析

圖3 花青素質(zhì)量濃度對SPI熒光強(qiáng)度的影響Fig. 3 Effects of different concentrations of anthocyanins on fl uorescence intensity of SPI

一般色氨酸殘基與酪氨酸殘基是蛋白質(zhì)的主要內(nèi)源熒光源，易受微環(huán)境極性的影響，因而可用作研究蛋白質(zhì)與小分子物質(zhì)相互作用的依據(jù)。本實驗采用內(nèi)源熒光分析方法研究了花青素與SPI復(fù)合后對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化。在280 nm波長下激發(fā)的SPI樣品熒光發(fā)射光譜主要發(fā)色基團(tuán)為色氨酸與酪氨酸。由圖3可知，花青素對SPI熒光具有明顯的猝滅作用，在一定質(zhì)量濃度SPI溶液條件下，花青素質(zhì)量濃度的升高會引起SPI熒光強(qiáng)度的降低，表明花青素與SPI相互作用時，將位于內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于水相中，導(dǎo)致蛋白發(fā)生熒光猝滅。同時，最大發(fā)射峰λmax紅移，由波長337.6 nm處偏移至339.6 nm處，表明蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)中的發(fā)色基團(tuán)在溶液中所處的微環(huán)境極性提高，肽鏈變得更加伸展。許銘珠等[27]根據(jù)猝滅常數(shù)判斷葡萄皮花青素與5 種蛋白相互作用的均為靜態(tài)猝滅。劉勤勤等[4]發(fā)現(xiàn)茶多酚會導(dǎo)致SPI熒光光譜紅移，與本實驗結(jié)果一致。

動態(tài)猝滅及靜態(tài)猝滅是引起SPI熒光猝滅的主要機(jī)制。動態(tài)猝滅過程中，升溫會導(dǎo)致猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而增加；反之，靜態(tài)猝滅的猝滅常數(shù)降低。因此，可通過Stern-Volmer方程，根據(jù)不同溫度下熒光強(qiáng)度的改變判定猝滅機(jī)制，公式如下：

式中：F0為未加入花青素時SPI的熒光強(qiáng)度；F為加入花青素后SPI的熒光強(qiáng)度；[Q]為花青素的總濃度/（mol/L）；KSV為動態(tài)猝滅常數(shù)/（L/mol）；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s））；τ0為猝滅劑不存在時熒光體的壽命（通常生物大分子的平均壽命約為10-8s[28-29]）。

表1 花青素對SPI的猝滅常數(shù)Table 1 Stern-Volmer quenching constants

各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大猝滅常數(shù)約為2.0×10 L/（mol·s），若Kq大于2.0×1010L/（mol·s）時為靜態(tài)猝滅；若Kq小于2.0×1010L/（mol·s）時為靜態(tài)猝滅。不同溫度下花青素對SPI的猝滅常數(shù)結(jié)果見表1，顯然花青素對SPI的猝滅機(jī)制主要為靜態(tài)猝滅，這進(jìn)一步說明花青素與SPI形成了不發(fā)光的復(fù)合物，從而導(dǎo)致SPI熒光強(qiáng)度降低。

2.4 圓二色光譜分析

選擇紫外光譜范圍為190～240 nm，測定不同質(zhì)量濃度的花青素與蛋白質(zhì)復(fù)合后的圓二色吸收，由圖4可以看出，在光譜范圍為200～230 nm時蛋白質(zhì)的平均殘基摩爾橢圓度[θ]發(fā)生了改變，通過CONTIN/LL程序計算，結(jié)果見表2。

圖4 不同質(zhì)量濃度花青素與SPI復(fù)合物的圓二色光譜Fig. 4 CD spectra of SPI complexes with different concentrations of anthocyanins

表2 花青素質(zhì)量濃度對SPI的二級結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effect of different concentrations of anthocyanins on protein secondary structure of SPI

SPI與不同質(zhì)量濃度花青素復(fù)合后，二級結(jié)構(gòu)含量發(fā)生了明顯變化。如表2所示，隨著花青素質(zhì)量濃度的增加，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低，β-折疊含量上升，轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)變化不明顯，當(dāng)花青素質(zhì)量濃度為1.000 mg/mL時，無規(guī)則卷曲含量明顯增加。可能是由于α-螺旋結(jié)構(gòu)中的疏水性氨基酸區(qū)域，從而使肽鏈延伸改變其空間構(gòu)象。Ali等[30]研究牛奶的乳清蛋白與咖啡酸相互作用導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)中的無規(guī)則卷曲含量升高。Liu Fuguo等[26]研究乳鐵蛋白與綠原酸、沒食子酸堿性條件下復(fù)合，結(jié)果表明乳鐵蛋白-綠原酸復(fù)合物、與乳鐵蛋白-沒食子酸復(fù)合物的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低，β-折疊含量增加，無規(guī)則卷曲含量增加，與本實驗結(jié)論一致。

2.5 炎癥代謝產(chǎn)物分析

TNF-α是細(xì)菌感染、組織破壞以及腫瘤細(xì)胞等多種刺激激活巨噬細(xì)胞而產(chǎn)生的一種引起炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子[31]。TNF-α能誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在一定質(zhì)量濃度范圍下可以保護(hù)細(xì)胞[32]，但過量的TNF-α?xí)?dǎo)致炎癥細(xì)胞因子的過度表達(dá)，從而引起一系列的炎癥反應(yīng)[33]。

花青素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎的功效[34]，先前研究表明蛋白與多酚的相互作用，會在一定程度影響多酚的生物活性[35]。花青素以及SPI-花青素復(fù)合物的劑量通過MTT實驗進(jìn)行檢測，劑量范圍為50～200 μg/mL，在該質(zhì)量濃度范圍下并未對細(xì)胞活力產(chǎn)生明顯影響。

圖5 200 μg/mL劑量下花青素及SPI-花青素復(fù)合物處理細(xì)胞后TNF-α的分泌量Fig. 5 TNF-α secretion after treatment with anthocyanins or SPI-anthocyanins complex at 200 μg/mL

圖6 200 μg/mL劑量下不同質(zhì)量濃度花青素與SPI復(fù)合物處理后NO的分泌量Fig. 6 NO production after treatment with different concentrations of SPI-anthocyanins complex at 200 μg/mL

本實驗以質(zhì)量濃度為10 ng/mL的LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞系，結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)細(xì)胞24 h后，TNF-α含量明顯增加，加入劑量為50、100 μg/mL的花青素及SPI-花青素復(fù)合物后，TNF-α含量幾乎無明顯變化（P＞0.05）。在200 μg/mL劑量下（圖5），TNF-α的分泌量隨花青素質(zhì)量濃度的升高而降低（P＜0.05）。在200 μg/mL劑量下（圖6），通過Griess試劑發(fā)現(xiàn)氮氧化物代謝量降低（P＜0.05），與不同質(zhì)量濃度花青素對TNF-α以及氮氧化物含量影響趨勢一致，但質(zhì)量濃度低于0.250 mg/mL時效果并不十分顯著。此外，發(fā)現(xiàn)SPI并未對炎癥產(chǎn)物TNF-α以及NO分泌量產(chǎn)生任何影響，花青素單獨(dú)存在時較SPI-花青素復(fù)合物炎癥產(chǎn)物分泌量少，可能是由于蛋白質(zhì)與花青素結(jié)合后會形成一定的空間位阻，間接降低了花青素的抗炎能力。綜上，低質(zhì)量濃度花青素與SPI復(fù)合后抗炎效果并不顯著，SPI-花青素復(fù)合物具有一定抗炎能力。

3 結(jié) 論

本實驗探究了在堿性條件下不同質(zhì)量濃度花青素與SPI復(fù)合，探究花青素質(zhì)量濃度對復(fù)合物結(jié)構(gòu)以及抗炎能力的影響，主要結(jié)論如下：1）隨著花青素質(zhì)量濃度的增加，SPI溶解度逐漸降低。2）SDS-PAGE表明，花青素會導(dǎo)致7S與11S中部分亞基的消耗，以及超大分子質(zhì)量亞基的形成。3）熒光色譜法分析表明，花青素能夠通過改變酪氨酸與色氨酸所處的極性微環(huán)境導(dǎo)致蛋白發(fā)生熒光猝滅，通過Stern-Volmer方程計算得出該猝滅方式為靜態(tài)猝滅。4）圓二色光譜法分析表明，花青素會導(dǎo)致SPI的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低，β-折疊與無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量增加。5）通過酶聯(lián)免疫法以及NO試劑盒對Raw264.7細(xì)胞炎癥代謝產(chǎn)物的分析表明，當(dāng)劑量為200 μg/mL時隨著體系花青素質(zhì)量濃度的增加，炎癥代謝物TNF-α與NO分泌量呈下降趨勢。