（吉林工商學(xué)院糧食學(xué)院，吉林長春130507）

糙米營養(yǎng)豐富，但由于保留了富含纖維質(zhì)的米糠層，使其口感較差、不易消化，嚴(yán)重限制了其銷量[1]。研究發(fā)現(xiàn)，糙米經(jīng)發(fā)芽后，食用品質(zhì)改善、化學(xué)成分改變[2]、營養(yǎng)價值會明顯提高[3]，同時會富集一些功能性營養(yǎng)成分[4-5]，尤其是對人體具有生理調(diào)節(jié)功能的γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），其含量是糙米的3 倍，大米的 10 倍[2，6]。

GABA是一種天然存在的四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，因具有改善腦機能、降血壓、抗衰老、促進(jìn)長期記憶以及預(yù)防消化道癌癥等多種保健功能，近年來受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[7-8]。研究表明，植物中的GABA合成轉(zhuǎn)化途徑有兩條，谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）和二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）分別為這兩條途徑合成GABA的關(guān)鍵酶[9]，其中GAD起主導(dǎo)作用。當(dāng)植物受到冷激、熱激、干旱、低氧脅迫、酸脅迫及鹽脅迫等逆境脅迫時，會強烈刺激兩種酶的活性，從而使GABA大量富集[10]，其中鹽脅迫法簡單易行，且安全環(huán)保[11]。GAD是一種Ca2+/鈣調(diào)節(jié)依賴型酶，具有一個鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)[12]。已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在植物籽粒發(fā)芽期間，施用Ca2+有助于GABA富集[13-14]。目前，鹽脅迫[1]、低氧脅迫[15]、低溫脅迫[16-17]對發(fā)芽糙米富集GABA的影響已有研究，而對NaCl脅迫聯(lián)合Ca2+處理下，優(yōu)化培養(yǎng)條件富集糙米GABA的研究還鮮有報道。

本文采用NaCl脅迫聯(lián)合Ca2+處理的方式培養(yǎng)糙米發(fā)芽，通過Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化了發(fā)芽糙米富集GABA的工藝條件，研究了NaCl濃度、Ca2+濃度、發(fā)芽溫度及發(fā)芽時間4個因素對GABA富集的影響，以期為糙米的開發(fā)利用及富含GABA健康食品的制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糙米：品種為龍粳31，產(chǎn)自黑龍江省；GABA標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）：Sigma試劑公司；其他試驗試劑均為分析純；試驗用水均為三級水。

1.2 儀器與設(shè)備

LHS-250HC-I型恒溫恒濕箱、DHG-9245A型鼓風(fēng)干燥箱、HWS-24型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JXFM110型錘式旋風(fēng)磨：杭州大吉光電儀器有限公司；N2型分光光度計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LE204E型分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；TGL-10C型高速臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 糙米發(fā)芽處理

選取籽粒飽滿、成熟度高、無裂痕的糙米粒，每份10.0 g，蒸餾水沖洗3遍，浸泡于1%的次氯酸鈉溶液中滅菌10 min，蒸餾水沖洗數(shù)次后濾干。加入10倍體積的一定濃度的NaCl和CaCl2混合溶液，30℃下浸泡12 h，取出后均勻的攤于鋪有濕潤紗布的培養(yǎng)皿中，蓋上紗布，其中紗布已用NaCl和CaCl2混合溶液潤濕，轉(zhuǎn)入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中，每隔4小時均勻噴灑2 mL NaCl和CaCl2混合溶液。培養(yǎng)結(jié)束后，用蒸餾水清洗3遍，放入45℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干，粉碎后即為發(fā)芽糙米粉，過80目篩，于4℃保存，備用。

1.3.2 發(fā)芽糙米中GABA含量的測定

采用Berthelot法測定發(fā)芽糙米中的GABA。準(zhǔn)確稱取2.0 g發(fā)芽糙米粉，蒸餾水定容至10 mL，超聲提取2小時后，3 000 r/min離心15 min，上清液中吸取400μL置于微量離心管中，加入600 μL pH=9.0硼酸緩沖溶液，混勻后分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的重蒸苯酚溶液2 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的次氯酸鈉溶液1 mL，振蕩混勻。沸水浴中煮沸10 min，迅速取出，置于冰浴中冷卻20 min，待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇溶液，630 nm處測定溶液吸光度值[18]。

1.3.3 單因素試驗

以NaCl溶液濃度、Ca2+溶液濃度、發(fā)芽溫度和發(fā)芽時間為試驗考察因素，以GABA為考察指標(biāo)，確定各因素對GABA富集量的影響。

表1 糙米發(fā)芽試驗方案Table 1 Design of experiment of germinated brown rice

1.3.4 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken試驗原理進(jìn)行四因素三水平的試驗設(shè)計。采用Design-Expert 10.0進(jìn)行試驗設(shè)計，以GABA含量為指標(biāo)，對響應(yīng)面試驗所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合優(yōu)化出最佳富集GABA的工藝條件。試驗自變量因素編碼及水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平Table 2 Factors and levels used in response surface experiments

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 NaCl溶液濃度對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響

NaCl溶液濃度對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響見圖1。

圖1NaCl溶液濃度對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響Fig.1 Effect of sodium chloride concentration on GABA content in germinated brown rice

如圖1所示，不同濃度的NaCl溶液對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響具有顯著性差異（P＜0.05）。NaCl溶液濃度低于10 mmol/L時，GABA含量隨著NaCl溶液濃度的增加而增大。這是由于NaCl溶液在一定濃度范圍內(nèi)會造成植物處于鹽脅迫逆境，從而促進(jìn)GABA生成[19]。當(dāng)NaCl溶液濃度達(dá)到10 mmol/L時，發(fā)芽糙米中GABA含量達(dá)到最大值，為101.82 mg/100 g，為未添加NaCl組（84.04 mg/100 g）的 1.21倍，此后，隨著 NaCl溶液濃度增大，GABA含量呈減小趨勢。

2.2.2 Ca2+溶液濃度對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響

Ca2+溶液濃度對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響見圖2。

圖2 Ca2+溶液濃度對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響Fig.2 Effect of Ca2+concentration on GABA content in germinated brown rice

如圖2所示，不同濃度的Ca2+溶液對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響具有顯著性差異（P＜0.05）。Ca2+濃度在0～40 mmol/L時，發(fā)芽糙米GABA含量隨著Ca2+濃度的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。這是由于添加Ca2+可提高GAD的活力[20]。當(dāng)Ca2+溶液在20mmol/L時，GABA含量最高，為106.25 mg/100 g，為未添加Ca2+組（77.37 mg/100 g）的1.37倍。這表明在糙米發(fā)芽過程中，添加適當(dāng)濃度的Ca2+溶液有助于富集GABA。

2.2.3 發(fā)芽溫度對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響

發(fā)芽溫度對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響見圖3。

圖3 發(fā)芽溫度對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響Fig.3 Effect of germination temperature on GABA content in germinated brown rice

如圖3所示，發(fā)芽溫度對糙米發(fā)芽富集GABA具有顯著性差異（P＜0.05）。發(fā)芽糙米的GABA主要是由發(fā)芽期間，糙米的胚芽所產(chǎn)生的[21]。當(dāng)浸泡溫度較低時，不利于糙米發(fā)芽。隨著溫度的升高，糙米發(fā)芽速度變快，同時GAD的活性也隨著溫度的提高而升高。當(dāng)發(fā)芽溫度在30℃時，GABA含量最高，為104.46 mg/100 g。隨著溫度的上升，GAD的活性受到抑制，導(dǎo)致GABA含量降低。因此，糙米發(fā)芽最適溫度為30℃。

2.2.4 發(fā)芽時間對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響

發(fā)芽時間對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響見圖4。

圖4 發(fā)芽時間對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響Fig.4 Effect of germination time on GABA content in germinated brown rice

如圖4所示，在1 d～2.5 d之間，隨著發(fā)芽時間的增加，GABA含量明顯增加，表明發(fā)芽時間對GABA含量具有顯著性差異（P＜0.05）。當(dāng)發(fā)芽2.5 d時，GABA含量為115.39 mg/100 g。發(fā)芽時間超過2.5 d時，隨著發(fā)芽時間的延長，GABA富集速度明顯變慢，當(dāng)發(fā)芽時間為3 d時，GABA含量為115.80 mg/100 g，與2.5 d沒有顯著性差異（P＞0.05），并且發(fā)芽時間過長，GABA會在轉(zhuǎn)氨酶的作用下，轉(zhuǎn)換成琥珀酸半醛，從而使GABA含量下降[22]。同時，發(fā)芽時間過長，會導(dǎo)致微生物生長，糙米發(fā)生霉變，品質(zhì)下降。綜合考慮，發(fā)芽時間為2.5 d較為適宜。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化糙米發(fā)芽工藝條件

2.2.1 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，應(yīng)用Design-Expert軟件，以 NaCl溶液濃度（X1）、Ca2+溶液濃度（X2）、發(fā)芽溫度（X3）和發(fā)芽時間（X4）作為自變量，以GABA含量為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行四因素三水平的Box-Behnken試驗，試驗設(shè)計及試驗結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Experiments design and results of Box-Behnken

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性檢驗結(jié)果

對表3試驗結(jié)果采用Design-Expert軟件進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面分析，建立了GABA（Y）二次響應(yīng)面回歸模型，擬合的二次多項式方程為：Y=132.07-21.01X1-11.07X2-1.99X3-1.88X4+15.53X1X2+6.25X1X3+8.28X1X4-0.30X2X3+6.74X2X4+10.95X3X4-16.40X12-21.56X22-20.36X32-15.07X42。

對該模型進(jìn)行顯著性檢驗，結(jié)果見表4。

表4 發(fā)芽糙米GABA富集條件優(yōu)化回歸模型顯著性檢驗Table 4 Significance test for the regression equation of optimal GABA accumulation conditions in germinated brown rice

該模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.992 6，修正相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.985 1，表明所建立的模型能解釋98.51%響應(yīng)值的變化，可以用此模型對糙米發(fā)芽富集GABA試驗進(jìn)行分析和預(yù)測。X1、X2、X1X2、X1X3、X1X4、X2X4、X3X4、X12、X22、X32及 X42均對 GABA 含量具有極顯著影響（P＜0.01），X3和 X4對 GABA 含量具有顯著影響（P＜0.05）。X2X3對GABA含量影響不顯著（P＞0.05）。四因素對GABA 含量的影響順序為 X1＞X2＞X3＞X4。剔除不顯著項，擬合方程修訂為：Y=132.07-21.01X1-11.07X2-1.99X3-1.88X4+15.53X1X2+6.25X1X3+8.28X1X4+6.74X2X4+10.95X3X4-16.40X12-21.56 X22-20.36X32-15.07X42。

圖5為GABA含量的實測值與模型預(yù)測值之間的相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 3，表明兩者之間的相關(guān)性極好。綜上所述，所建立模型能很好的對GABA含量進(jìn)行預(yù)測。

圖5 發(fā)芽糙米GABA含量實測值與預(yù)測值之間的相關(guān)性Fig.5 Correlation between predicted and observed values of GABA content in germinated brown rice

2.2.3 響應(yīng)面分析

圖6 NaCl溶液濃度（X1）和 Ca2+溶液濃度（X2）響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour polt showing the effects of sodium chloride concentration（X1）and Ca2+concentration（X2）

圖7 NaCl溶液濃度（X1）和發(fā)芽溫度（X3）響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour polt showing the effects of sodium chloride concentration（X1）and germination temperature（X3）

圖8 NaCl溶液濃度（X1）和發(fā)芽時間（X4）響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour polt showing the effects of sodium chloride concentration（X1）and germination time（X4）

圖9 Ca2+溶液濃度（X2）和發(fā)芽溫度（X3）響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour polt showing the effects of Ca2+concentration（X2）and germination temperature（X3）

圖10 Ca2+溶液濃度（X2）和發(fā)芽時間（X4）響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.10 Response surface and contour polt showing the effects of Ca2+concentration（X2）and germination time（X4）

圖6～圖11為根據(jù)線性回歸模型繪制的響應(yīng)面及其等高線圖。根據(jù)此結(jié)果可以直觀分析因素間的交互作用對GABA含量的影響。響應(yīng)面越陡峭，表明該試驗條件的改變對GABA含量影響越大[23]。從響應(yīng)面圖可以看出，4個因素所形成的坡度都比較陡峭，尤其是X1和X2兩個因素更為陡峭，表明NaCl濃度和Ca2+濃度對GABA含量的影響較其余兩個因素要大。4個因素的變化趨勢均為先增大后降低，6個響應(yīng)面均存在一個極大值點。等高線的性狀反應(yīng)了因素間的交互作用的強弱，等高線呈橢圓形，表明兩個因素的交互作用顯著，呈圓形，則表明兩個因素的交互作用不顯著[24]。除圖9外，5個等高線圖均呈橢圓形，表明除Ca2+濃度和發(fā)芽溫度交互作用不顯著外，其余各兩因素間交互作用顯著。這一結(jié)果與顯著性分析結(jié)論相符。

圖11 發(fā)芽溫度（X3）和發(fā)芽時間（X4）響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.11 Response surface and contour polt showing the effects of germination temperature（X3）and germination time（X4）

2.2.4 最優(yōu)條件的確定及驗證

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化分析，得到糙米發(fā)芽富集GABA的最佳工藝條件為NaCl溶液濃度為7.390 mmol/L，Ca2+溶液濃度為14.940 mmol/L，發(fā)芽溫度為28.829℃，發(fā)芽時間為2.298 d，預(yù)測發(fā)芽糙米GABA含量為145.29 mg/100 g。根據(jù)實際操作條件，將富集工藝調(diào)整為NaCl溶液濃度為7.50 mmol/L，Ca2+溶液濃度為15.0 mmol/L，發(fā)芽溫度為29℃，發(fā)芽時間為2.3 d。在此條件下進(jìn)行糙米發(fā)芽富集GABA，作6次平行試驗，得GABA平均含量為144.98 mg/100 g。預(yù)測值與實測值相對誤差較小，說明所建立的模型具有較好的準(zhǔn)確性及可靠性。

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以GABA含量為指標(biāo)，采用Design-Expert軟件應(yīng)用Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行四因素三水平優(yōu)化試驗。方差分析結(jié)果表明NaCl濃度和Ca2+濃度對GABA含量具有極顯著性影響；NaCl濃度和Ca2+濃度、NaCl濃度和發(fā)芽溫度、NaCl濃度和發(fā)芽溫度、Ca2+濃度和發(fā)芽時間、發(fā)芽溫度和發(fā)芽時間的交互作用對GABA含量具有極顯著性影響；發(fā)芽溫度和發(fā)芽時間對GABA含量具有顯著性影響；Ca2+濃度和發(fā)芽溫度的交互作用對GABA含量無顯著性影響。由回歸方程得出，當(dāng)NaCl濃度為7.390 mmol/L，Ca2+溶液濃度為14.940 mmol/L，發(fā)芽溫度為28.829℃，發(fā)芽時間為2.298 d時，發(fā)芽糙米GABA含量最大，預(yù)測值為145.29 mg/100 g?？紤]到實際操作的可行性，最后優(yōu)化的富集條件為NaCl濃度為7.50 mmol/L，Ca2+濃度為15.0 mmol/L，發(fā)芽溫度為29℃，發(fā)芽時間為2.3 d。通過驗證試驗，實測值與預(yù)測值基本相符，說明所建立的回歸模型可較為準(zhǔn)確的預(yù)測發(fā)芽糙米GABA含量，通過優(yōu)化，可有效提高GABA含量，具有一定的實際指導(dǎo)意義。