雷玉華 趙勁波 張長(zhǎng)江 李元紅

早期再灌注治療是臨床上治療心肌梗死最有效的方法，然而再灌注治療本身也會(huì)引起心肌細(xì)胞損傷，這種現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注(isechemia and reperfusion,IR)損傷。前期研究證實(shí)，急性心肌缺血如果不給予再灌注治療，缺血區(qū)梗死面積可達(dá)70%，即使給予再灌注治療后心肌梗死面積仍有30%，而如果給予有效的方法預(yù)防再灌注損傷時(shí)，心肌梗死面積僅有5%[1]?？梢娙绾螠p輕IR損傷，對(duì)挽救患者心肌改善預(yù)后具有重要意義。近年來隨著我國(guó)急診經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention, PCI)的增多，如何預(yù)防和治療IR損傷應(yīng)該給與更多的重視。

心肌IR中，氧化應(yīng)激和過度自噬是心肌損傷的重要機(jī)制[2-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)自主神經(jīng)失衡，表現(xiàn)為交感神經(jīng)過度激活，迷走神經(jīng)活性相對(duì)減弱，是氧化應(yīng)激過度激活的機(jī)制之一，通過頸迷走神經(jīng)刺激(cervical vagus nerve stimulation,CVNS)可以顯著抑制IR中氧化應(yīng)激水平，減輕心肌IR損傷[4-5]。在再灌注階段，氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)細(xì)胞過度自噬的首要原因。因此我們推測(cè)自噬也參與了CVNS對(duì)大鼠心肌IR的保護(hù)作用。本文試探討CVNS是否通過抑制心肌細(xì)胞過度自噬，減輕心肌IR損傷。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分組 選用成年雄性SD大鼠(200～250g)，購(gòu)于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。將24只大鼠隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組(SO組)(n=8):大鼠麻醉后開胸，前降支下穿線但不結(jié)扎；缺血再灌注組(I/R組)(n=8)：前降支扎閉30min后，再灌2h；頸迷走神經(jīng)刺激+缺血再灌注組(VNS+I/R組)(n=8)：前降支扎閉時(shí)開始給予頸迷走神經(jīng)電刺激，至再灌注2h結(jié)束。

用2%的戊巴比妥鈉(45mg/kg，腹腔注射)麻醉后，將大鼠仰臥固定于鼠板，氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)(70次/min)，記錄肢導(dǎo)心電圖(BIOPAC，美國(guó))，直至再灌注結(jié)束。開胸后，將大鼠前降支與一段帶凹槽的中空乳膠管用5-0線一同結(jié)扎，結(jié)扎后心尖部心肌發(fā)白，II導(dǎo)聯(lián)ST段上抬，提示缺血成功，30min后剪斷結(jié)扎線，再灌注2h。結(jié)扎后心尖部變白和心電圖II導(dǎo)聯(lián)ST段抬高表示缺血成功。

再灌注后，經(jīng)頸靜脈采血2mL，靜置后離心，取上清，凍存于-80℃冰箱至檢測(cè)。迅速剪取心臟，清洗后，留取左心室心尖區(qū)(梗死+缺血區(qū))心肌，凍存于-80℃冰箱至檢測(cè)。

2.頸迷走神經(jīng)刺激 SO和I/R組中，僅分離右側(cè)經(jīng)迷走神經(jīng)干。CVNS+I/R組中，分離右側(cè)經(jīng)迷走神經(jīng)干，用自制銀電極鉤，鉤住迷走神經(jīng)干給予電刺激(10Hz，脈寬：2ms)以心率下降10%為理想電壓(本實(shí)驗(yàn)電壓值1-7v不等)，刺激由缺血前開始至再灌注后結(jié)束。

3.心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè) 檢測(cè)大鼠血清中肌酸激酶(creatine kinase，CK)和肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)水平，評(píng)價(jià)心肌損傷情況。選用南京建成生物工程所試劑盒，檢測(cè)血清CK和cTnI水平，嚴(yán)格按照操作說明操作。

4.MDA和SOD檢測(cè) 檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)丙二醛(malonaldehyde，MDA)水平和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激水平。選用武漢建成生物工程所試劑盒，檢測(cè)MDA水平盒SOD活性，嚴(yán)格按著說明操作。

5.Western blot檢測(cè) 采用WB法檢測(cè)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)和自噬蛋白LC3和beclin-1的表達(dá)。方法如前所述[8]，簡(jiǎn)言之，采用12%PAGE膠，電泳轉(zhuǎn)膜后，選用5%脫脂奶粉封閉，4℃孵育一抗[抗LC3(1∶500稀釋，sigma，美國(guó))，抗Bcl-2(1∶500，santa，美國(guó))，抗Beclin-1(1∶500，Abcam，英國(guó))]過夜，用相應(yīng)的二抗孵育后，ECL顯色，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算三種凋亡蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

6.數(shù)據(jù)分析 采用SPSS17.0軟件包分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.CVNS減輕心肌IR損傷 與SO組比較，IR組CK和cTnI的表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與I/R組比較，CVNS+I/R組中，CK和cTnI的表達(dá)顯著下降(P<0.05，表1)。

2.CVNS抑制氧化應(yīng)激 與SO組比較，IR組中MDA水平顯著增加，SOD活性顯著降低(P<0.05)；與IR組比較，CVNS可以顯著抑制MDA的表達(dá)，增加SOD的活性(P<0.05，表1)。

3. CVNS抑制心肌細(xì)胞Bcl-2的表達(dá) 與SO組和IR組比較，CVNS+IR組中Bcl-2的表達(dá)顯著升高(P<0.05，表2)。

4.CVNS抑制心肌細(xì)胞過度自噬 與SO組比較，IR組中beclin-1水平和LC3-II/I值顯著增加(P<0.05)。與IR組比較，CVNS可以顯著抑制beclin-1的表達(dá)和LC3-II/I值(P<0.05，表2，圖1)。

表1 CVNS對(duì)心肌損傷和氧化應(yīng)激的影響

注：與SO組比較，*P<0.05；與IR組比較，#P<0.05

表2 CVNS對(duì)細(xì)胞自噬的影響

注：與SO組比較，*P<0.05；與IR組比較，#P<0.05

頸迷走神經(jīng)刺激是一種有效的心臟自主神經(jīng)再平衡策略，可以顯著抑制IR誘導(dǎo)的過度氧化應(yīng)激和心肌損傷[4-5]。本研究進(jìn)一步印證了上述結(jié)論，但本研究還發(fā)現(xiàn)，CVNS還可以有效抑制IR中心肌細(xì)胞過度自噬。

圖1 CVNS對(duì)自噬蛋白表達(dá)的影響

討 論

一般認(rèn)為，自噬是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，可以吞噬破損的細(xì)胞器、降解的蛋白等，對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要意義。但在心肌IR模型中，研究證實(shí)，缺血期細(xì)胞自噬具有保護(hù)作用，而再灌注階段大量活性氧的產(chǎn)生可以引起細(xì)胞過度自噬，造成心肌損傷[4,6-7]。研究[8-9]證實(shí)，在再灌注階段自噬被過度激活，表現(xiàn)為beclin-1表達(dá)的增高和Bcl-2表達(dá)降低，bcl-2表達(dá)降低可進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Beclin-1是自噬的關(guān)鍵蛋白，它調(diào)節(jié)自噬小體的形成和發(fā)展。再灌注階段beclin-1表達(dá)顯著增加，而通過siRNA抑制beclin-1表達(dá)可以顯著抑制細(xì)胞自噬水平和再灌注損傷[10-11]。另外，Brady等[12]研究證實(shí)，在饑餓狀態(tài)下，Bcl-2可以與肌漿網(wǎng)結(jié)合，通過抑制鈣超載抑制細(xì)胞過度自噬的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，CVNS可以有效抑制Beclin-1的高表達(dá)，增加Bcl-2的表達(dá)，因此抑制了細(xì)胞過度自噬。我們知道，與缺血期相比，再灌注階段大量活性氧的產(chǎn)生取代了能量耗竭，成為再灌注損傷的首要因素。Hariharan等[13]研究發(fā)現(xiàn)，活性氧的產(chǎn)生往往伴隨著beclin-1的高表達(dá)，而給予還原劑MPG可以有效抑制beclin-1表達(dá)，提示活性氧可能是再灌注階段引起beclin-1高表達(dá)和細(xì)胞過度自噬的重要因素。另外研究發(fā)現(xiàn)，活性氧可以抑制自噬相關(guān)4(ATG4)活性、酯化LC3、激活細(xì)胞自噬[14]。這些結(jié)果均表明，活性氧是誘導(dǎo)細(xì)胞過度自噬的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)，CVNS可以有效抑制活性氧的產(chǎn)生，抑制心肌細(xì)胞過度自噬，因此我們推測(cè)在IR模型中，CVNS可能是通過抑制氧化應(yīng)激抑制心肌細(xì)胞過度自噬。

再灌注治療是治療急性心肌梗死最有效的方法，而再灌注損傷極大的限制了再灌注治療的療效，本研究發(fā)現(xiàn)CVNS可以有效抑制IR中心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和自噬水平，從而減輕再灌注心肌損傷。因此研究者認(rèn)為，在臨床上，對(duì)于急診PCI患者可以給與無創(chuàng)頸部迷走神經(jīng)或耳緣迷走神經(jīng)刺激，從而有效減輕心肌IR損傷，改善急性心梗患者預(yù)后。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)：1CVNS可以有效抑制IR中心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和細(xì)胞損傷；2CVNS可以顯著抑制IR引起的細(xì)胞過度自噬，其機(jī)制可能與增加Bcl-2表達(dá)、抑制氧化應(yīng)激水平有關(guān)。