汪 靜 黃利紅

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢 430014)

p53是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，同時(shí)也是研究最廣泛的抑癌基因，p53在致DNA損傷因子、氧化應(yīng)激、熱休克、紫外照射等壓力刺激下被激活，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞DNA損傷修復(fù)、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡以維持胞內(nèi)遺傳信息的穩(wěn)定性〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，在約50%的人類癌癥細(xì)胞中，p53基因發(fā)生變異，造成p53失活〔2〕。在另外近50%的癌癥細(xì)胞中，p53基因并沒有發(fā)生變異，但活性則被其下游靶基因MDM2的負(fù)反饋?zhàn)饔枚灰种?，使?xì)胞因無法修復(fù)受損基因而進(jìn)入惡性分裂、誘變癌癥〔3〕。研究證實(shí)，MDM2基因的過表達(dá)與肺癌、卵巢癌、膀胱癌及肝癌等惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)〔4〕。針對(duì)MDM2在N端的p53結(jié)合域的分子抑制劑的研發(fā)是近年來腫瘤藥物開發(fā)的熱門〔5〕。MI-219是一種高效MDM2抑制劑，可以有效阻斷MDM2對(duì)p53的降解作用，激活細(xì)胞內(nèi)野生型p53的活性，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，臨床前研究表明其在動(dòng)物體內(nèi)可以作為癌癥治療的候選藥物〔6〕。因此，研究MI-219發(fā)揮作用的詳細(xì)分子機(jī)制有利于對(duì)其進(jìn)一步開發(fā)和利用。卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在女性患者中，其發(fā)病率僅次于子宮內(nèi)膜癌，在全球范圍內(nèi)每年以2%的速度遞增?，F(xiàn)階段卵巢癌的治療仍以手術(shù)為主，配合化療，但是化療療效則一直受制于耐藥和化療藥物副作用。因此，探索新的治療靶點(diǎn)并開發(fā)高效、靶向、低毒的優(yōu)化方案是現(xiàn)階段卵巢癌治療的首選舉措。本研究擬探討MI-219與常用化療藥物阿霉素(ADM)聯(lián)用對(duì)人卵巢癌耐阿霉素細(xì)胞株A2780/ADM增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基均為Hyclone公司產(chǎn)品。ADM(注射用鹽酸多柔比星)為山西普德藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品(國(guó)藥準(zhǔn)字：H14023143)。MI-219為美國(guó)Selleck公司產(chǎn)品(目錄號(hào)：S8059)。四甲基氮唑鹽(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供，凋亡檢測(cè)試劑盒為杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。胞質(zhì)蛋白分離試劑盒碧云天生物技術(shù)研究所提供。兔抗人MDM2、phospho-p53、XIAP、Caspase3、Caspase9及鼠抗人β-actin一抗，羊抗兔、羊抗鼠二抗均購(gòu)自南京巴傲德生物科技有限公司。其他常用化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌耐ADM細(xì)胞株A2780/ADM購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中。

1.2.2MTT試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的耐藥細(xì)胞A2780/ADM，以0.25%胰蛋白酶消化制備成單細(xì)胞懸液(2×105)，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。首先篩選MI-219無毒/低毒濃度范圍，以倍比稀釋的方法由高到低分別加入5.000 μmol/L、2.500 μmol/L、1.250 μmol/L和0.625 μmol/L濃度的MI-219，對(duì)照組不加藥物只加培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，藥物作用24 h后，棄上清，每孔加入100 μl MTT 溶液(終濃度為0.05 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸去各孔內(nèi)液體，每孔加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO)，于Synergy 2 型多功能酶標(biāo)儀讀取吸光度值(A570)。細(xì)胞活性(%)=〔處理組OD值/空白組OD值〕×100。計(jì)算出無毒、低毒濃度MI-219后，再次制備成A2780/ADM細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞隨機(jī)分為4組：①對(duì)照組(不加任何處理)；②ADM組(0.625 mg/L ADM)；③ADM+0.625 μmol/L MI-219組；④ADM+1.250 μmol/L MI-219組。處理步驟同上。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 選處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A2780/ADM細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)，在加藥前1 d，以每孔2.0×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中。按細(xì)胞1.2.2方法經(jīng)ADM或ADM+MI-219處理24 h后，PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化，3 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取5.0×105個(gè)重懸的細(xì)胞，3 000 r/min離心5 min，棄上清，按說明書要求加入500 μl 上樣緩沖液輕輕混勻；后加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI溶液混勻，室溫避光作用15～20 min，于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。Cellquest軟件分析檢測(cè)結(jié)果。

1.2.4Western印跡檢測(cè) 加藥前1 d選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A2780/ADM細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，以每瓶5.0×106個(gè)細(xì)胞接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。按1.2.2方法分組及處理24 h后，預(yù)冷PBS洗滌2次，胰酶消化，離心收集細(xì)胞。RIPA裂解液處理細(xì)胞，提取上清液，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)量蛋白濃度。取等量蛋白樣品(每孔30 μg)與蛋白上樣緩沖液按4∶1比例混勻，95℃水浴變性10 min。經(jīng)12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳2.5 h，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至0.45 μmol/L PVDF膜，后經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h。經(jīng)一抗、二抗孵育后，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)超敏發(fā)光液顯色，采用多功能凝膠成像分析儀檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，以β-actin作為等量蛋白上樣對(duì)照，通過Genetool凝膠圖像分析軟件對(duì)各組蛋白條帶的密度值進(jìn)行比較分析。

1.2.5ELISA試驗(yàn)分析胞質(zhì)Cytochrome C水平 加藥前1 d選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A2780/ADM細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，以每瓶5.0×106個(gè)細(xì)胞接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。經(jīng)1.2.2方法分組及處理24 h后，參照胞質(zhì)蛋白分離試劑盒說明書分離各組胞質(zhì)蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)量蛋白濃度。取10 μg胞質(zhì)蛋白稀釋至100 μl加入進(jìn)ELISA試劑盒的樣本孔中，按說明書要求，經(jīng)洗板、加抗體、洗板、加酶、洗板、顯色、終止，最后于Synergy 2 型多功能酶標(biāo)儀讀取吸光度值(A450)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果 A2780/ADM細(xì)胞經(jīng)0.625、1.250、2.500及5.000 μmol/L MI-219處理24 h后，各處理組A2780/ADM細(xì)胞增殖率呈劑量依賴性降低，分別為：97%、86%、72%和61%，其中5.000 μmol/L、2.500 μmol/L、1.250 μmol/L處理組與對(duì)照組(100%)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。確定0.625 μmol/L MI-219為非細(xì)胞毒性劑量(生存率>95%)、1.250 μmol/L MI-219為低細(xì)胞毒性劑量(生存率>85%)。MI-219和ADM聯(lián)合處理對(duì)A2780/ADM細(xì)胞增殖率影響結(jié)果顯示：無論ADM單獨(dú)處理或與MI-219聯(lián)合處理均可顯著降低A2780/ADM細(xì)胞增殖率(P<0.05)；ADM組細(xì)胞增殖率為87%；0.625 mg/L ADM+0.625 μmol/L MI-219組，A2780/ADM細(xì)胞增殖率為76%；ADM+1.250 μmol/L MI-219組細(xì)胞增殖率為61%；聯(lián)合處理組細(xì)胞增殖率均顯著低于ADM組(P<0.05)。

2.2細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 ADM組細(xì)胞凋亡率為14%；ADM+0.625 μmol/L MI-219組細(xì)胞凋亡率為26%；當(dāng)0.625 mg/L ADM與1.250 μmol/L MI-219共同處理時(shí)，A2780/ADM細(xì)胞凋亡率為41%；聯(lián)合處理組細(xì)胞凋亡率均顯著高于ADM組(P<0.01)。

2.3Western印跡結(jié)果 在ADM組、ADM+0.625 μmol/L MI-219組、ADM+1.250 μmol/L MI-219組中，MDM2和XIAP蛋白表達(dá)逐漸減少，在ADM+1.250 μmol/L MI-219組中表達(dá)最低，且以上蛋白在聯(lián)合處理組中的表達(dá)也明顯低于ADM組；而活化型p53、Caspase3、Caspase9表達(dá)在ADM組、ADM+0.625 μmol/L MI-219組、ADM+1.250 μmol/L MI-219組中則明顯增加，在ADM+1.250 μmol/L MI-219組中表達(dá)量最高，且以上蛋白在聯(lián)合處理組中的表達(dá)也明顯高于ADM組。見圖1，表1。所有組中β-actin表達(dá)水平無變化，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信。

1～4：空白組、ADM組、ADM+0.625 μmol/L MI-219組及ADM+1.250 μmol/L MI-219組圖1 Western 印跡檢測(cè)各組細(xì)胞MDM2、XIAP、活化型p53、Caspase3和Caspase9表達(dá)

表1 各組Western印跡檢測(cè)各蛋白表達(dá)水平均數(shù)比較(n=3)

與ADM組比較：1)P<0.05；與其他組比較：2)P<0.05

2.4ELISA分析胞質(zhì)Cytochrome C水平 ADM單獨(dú)處理或與MI-219聯(lián)合處理均可顯著增加胞質(zhì)Cytochrome C水平，ADM組吸光值約為1.29；ADM+0.625 μmol/L MI-219組吸光值約為1.90；當(dāng)ADM+1.25 μmol/L MI-219組吸光值約為2.80；聯(lián)合處理組吸光值均顯著高于ADM，與空白組(吸光值約為0.47)(均P<0.01)。

3 討 論

MDM2作為p53的靶基因可以通過兩種機(jī)制調(diào)節(jié)p53，首先，通過其N端p53 結(jié)合域與p53 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域結(jié)合阻礙后者發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用，其次，MDM2作為E3泛素化酶，可以介導(dǎo)p53的泛素化降解及其核移位過程〔7～9〕。同時(shí)，MDM2還可以在蛋白質(zhì)翻譯水平上調(diào)XIAP，而后者則通過下調(diào)Caspase3和Caspase9的活性來抑制細(xì)胞凋亡〔10，11〕。無論是p53活性被抑制還是XIAP過表達(dá)均可導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入惡性分裂而誘變癌癥。因此，MDM2小分子抑制劑的研發(fā)是抗癌藥物設(shè)計(jì)的熱門靶點(diǎn)之一。本研究提示MI-219是有效的抗腫瘤化合物。當(dāng)非細(xì)胞毒性劑量的MI-219與ADM聯(lián)合作用時(shí)可顯著增加后者的增殖抑制作用，低細(xì)胞毒性劑量的MI-219與ADM聯(lián)合作用時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用更為明顯。兩種劑量的MI-219與ADM聯(lián)用時(shí)可明顯抑制MDM2和XIAP蛋白表達(dá)，而活化型p53、Caspase3和Caspase9表達(dá)量及Cytochrome C水平則明顯升高。因?yàn)镃ytochrome C的釋放是線粒體依賴性細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵事件，因此，提示MI-219通過抑制MDM2的活性進(jìn)而促進(jìn)野生型p53的活化及凋亡抑制因子XIAP的下調(diào)，增強(qiáng)了卵巢癌耐藥細(xì)胞株A2780/ADM對(duì)ADM的敏感性。