蔡克瑞 劉志新 孫曉冬 閆 磊

(牡丹江醫(yī)學院組胚教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

肉蓯蓉為國家二級保護植物，含多種活性成分，多糖是其主要活性成分之一。肉蓯蓉及其有效成分具有抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤、增強機體免疫力等藥理作用，但有關(guān)肉蓯蓉多糖對衰老小鼠腦神經(jīng)細胞保護作用的研究尚未見報道。本實驗擬探討肉蓯蓉多糖對衰老小鼠腦神經(jīng)細胞的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1材料 昆明種小鼠60只，雌雄各半(牡丹江醫(yī)學院實驗動物中心提供)。D-半乳糖(上海試劑二廠)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)；細胞凋亡、Bcl-2、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物制品有限公司)；TritonX-100、二甲基亞砜、胰蛋白酶(華舜生物工程有限公司)；Scout-Ⅱ半自動生化分析儀；R201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；真空泵，恒壓穩(wěn)流電泳儀，生化培養(yǎng)箱，OLYMPUS熒光顯微鏡。

1.2方法

1.2.1肉蓯蓉多糖的制備 肉蓯蓉生藥片，經(jīng)熱乙醇浸泡3 h后，紗布過濾后棄濾液。藥渣加水煎煮3次，每次1～2 h，過濾后合并濾液。蒸發(fā)濃縮后離心去沉淀，上清液加2～3倍體積的95%乙醇沉淀，4℃靜置24 h，次日4℃ 6 000 r/min離心20 min收集沉淀。沉淀經(jīng)水復溶、脫蛋白透析、冷凍干燥后獲粗多糖。

1.2.2D-半乳糖致衰小鼠模型的建立 60只昆明種小鼠隨機分為青年對照組，衰老模型組，肉蓯蓉多糖組，每組20只。衰老模型組和肉蓯蓉多糖組每日上午頸背部皮下注射D-半乳糖100 mg/kg，連續(xù)30 d。青年對照組每日頸背部皮下注射相同劑量的生理鹽水。每天皮下注射的同時灌胃給藥，肉蓯蓉多糖組灌服肉蓯蓉多糖(折合生藥0.01 g/ml)，青年對照組和衰老模型組每日灌胃相同劑量的蒸餾水，連續(xù)30 d。

1.2.3動物處理及指標測定 30 d后所有小鼠斷頭處死，立即取出腦組織，取大腦中部中性甲醛固定。余下腦組織一部分用生理鹽水制成勻漿，一部分用胰蛋白酶消化制成單細胞懸液。

取腦組織勻漿，按SOD、MDA、GSH-Px試劑盒說明書操作，用半自動生化分析儀比色分析測定結(jié)果。DNA的損傷率采用單細胞凝膠電泳法即彗星實驗檢測；TUNEL法觀察神經(jīng)細胞凋亡數(shù)；免疫組化法檢測Bcl-2基因表達。

1.3統(tǒng)計學處理 用SPSS16.0軟件行q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1肉蓯蓉多糖對小鼠腦SOD、MDA、GSH-Px、DNA損傷率和細胞凋亡的影響 灌服肉蓯蓉多糖可提高致衰小鼠SOD活性、GSH-Px活力，降低MDA含量，增強神經(jīng)細胞DNA損傷的修復能力，減少凋亡細胞數(shù)。見表1，圖1～3。

表1 肉蓯蓉多糖對D-半乳糖致衰小鼠腦神經(jīng)細胞的影響

與青年對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與衰老模型組比較：3)P<0.01

圖1 小鼠腦組織HE染色(×100)

圖2 衰老模型組腦神經(jīng)細胞凋亡(×400)

圖3 肉蓯蓉多糖組腦神經(jīng)細胞凋亡(×400)

2.2肉蓯蓉多糖對腦組織Bcl-2表達強度的影響 青年對照組腦組織Bcl-2陽性表達18例，衰老模型組為4例，肉蓯蓉多糖組為16例，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。肉蓯蓉多糖可增強D-半乳糖致衰小鼠腦神經(jīng)細胞Bcl-2表達強度。見圖4。

圖4 衰老模型組和肉蓯蓉多糖組腦組織Bcl-2表達(免疫組化法)

3 討 論

衰老自由基學說認為人類隨年齡增長的退行性變化是由自由基活性氧化損傷作用所致。D-半乳糖致亞急性中毒狀態(tài)下，體內(nèi)產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基，對組織產(chǎn)生過氧化損害，這種生化和組織結(jié)構(gòu)的改變與自然衰老表現(xiàn)基本吻合。有研究發(fā)現(xiàn)，細胞程序性死亡對衰老起主動作用，并引起特征性形態(tài)改變及衰老性生長停滯，衰老細胞死亡的實質(zhì)就是細胞凋亡〔1〕。Bcl-2家族蛋白在調(diào)控神經(jīng)細胞凋亡和生存中發(fā)揮重要作用，家族成員包括促凋亡基因和抑制凋亡基因，抑制細胞凋亡的基因主要有Bcl-2、Bcl-xl等。Bcl-2基因是一種原癌基因，具有抑制細胞凋亡的作用〔2，3〕。Bcl-2的過度表達可減少神經(jīng)元程序性細胞死亡，引起特定腦區(qū)內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目增多。

肉蓯蓉又名金筍、地精，為列當科植物肉蓯蓉或管花肉蓯蓉的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，主產(chǎn)于內(nèi)蒙古、甘肅、新疆、青海等地；性溫、味甘咸，為補腎壯陽、潤腸通便之要藥，有“沙漠人參”的美譽，《中國藥典》2010年版收錄的肉蓯蓉和管花肉蓯蓉為正品藥材〔4，5〕。現(xiàn)代藥理研究也證明肉蓯蓉除具有補腎壯陽、潤腸通便作用外，還具有抗疲勞、抗衰老、增強機體免疫力及增強記憶力等作用。吳波等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉總苷能明顯提高亞急性衰老小鼠抗氧化及延緩衰老的作用；尹剛等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉多糖通過調(diào)控抗凋亡基因表達水平抑制大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡，這與本實驗觀察到的結(jié)果相似。本實驗結(jié)果顯示灌服肉蓯蓉多糖后，衰老小鼠各項衰老指標得以改善，其原因與以下因素有關(guān)：①肉蓯蓉多糖作為一種功效顯著的天然抗氧化劑，可清除超氧自由基、羥自由基、單線態(tài)氧等多種自由基及其代謝產(chǎn)物，使SOD的消耗減少、活性上升，MDA含量下降。②肉蓯蓉多糖中含有多種人體必需的微量元素，能提高DNA損傷的修復能力。③肉蓯蓉多糖有促進代謝、調(diào)節(jié)基因表達的作用，上調(diào)Bcl-2基因表達水平，通過Bcl-2發(fā)揮其抗氧化作用，可減少氧自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化物的形成，減少體內(nèi)自由基積聚引起的一系列連鎖反應(yīng)，減少DNA氧化損傷，抑制氧化應(yīng)激誘導的細胞凋亡的發(fā)生，對腦神經(jīng)細胞起到保護作用。

綜上，肉蓯蓉多糖具有改善衰老小鼠腦神經(jīng)細胞損傷的作用，這種作用與其抗氧化、抗凋亡及上調(diào)Bcl-2表達水平有關(guān)，但Bcl-2表達與激活途徑的具體機制及與抗氧化、抗凋亡之間的關(guān)系還不清楚，將在進一步的實驗中深入研究。