郭志鋼,王 涵,王 冠,李妍哲,田 宇,李朝暉*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)外二科，吉林 長春130033； 2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長春130010)

HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)是一種典型的反義長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,IncRNA)，其在多種腫瘤中表達(dá)異常增高。HOTAIR在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[1-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤中HOTAIR呈高表達(dá)，但在膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制尚不明確[4]。本研究通過小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172中HOTAIR的表達(dá)，觀察HOTAIR下調(diào)后對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲的影響，進(jìn)一步揭示HOTAIR在膠質(zhì)瘤中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

DMEM培養(yǎng)基購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，DMSO和MTT購自杭州昊天生物公司，Ultra SYBR熒光定量PCR試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。細(xì)胞周期DNA含量檢測試劑盒和Lipofectamine2000購自南京凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172和人星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800均購自中科院上海細(xì)胞所。A172細(xì)胞和HA1800細(xì)胞培養(yǎng)于含青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL 、10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

Trizol試劑提取總RNA。檢測RNA濃度，HiFi-MMLV cDNA試劑盒合成第一鏈cDNA。

逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用SYBR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，β-actin作為內(nèi)參基因。 HOTAIR引物，上游：5’- CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3’，下游：5’-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3’。β-actin引物，上游：5’-GGCACCACACCTTCTACAAT-3’，下游：5’-GTGGTGGTGAAGCTGTAGCC-3’。real-time PCR反應(yīng)條件：95℃，10 min；94℃，30 s， 58℃，30 s，72℃，60 s，40個(gè)循環(huán)；72℃，10min。qRT-PCR結(jié)果利用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算分析。

1.4si-HOTAIR轉(zhuǎn)染

si-HOTAIR序列為5’-GCGCCUUCCUUAUAAGUAUTT-3’，陰性對照(negative control,NC)序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。Lipofectamine 2000 試劑轉(zhuǎn)染，qRT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)分si-HOTAIR組、NC組及空白對照組(Blank)。

1.5MTT法檢測細(xì)胞增殖率

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以2×104/ml的密度接種在96孔培養(yǎng)板上，每孔100 μl。細(xì)胞增至50%-60%時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。采用MTT法測定細(xì)胞生長活性，以570 nm波長吸光度OD值表示，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=處理組OD值/對照組OD值。

1.6Guava微流式細(xì)胞分析儀檢測細(xì)胞周期

收集細(xì)胞，用PBS洗滌，加入700 mL/L乙醇1 ml，固定過夜。第2 天離心去除乙醇，以含2 g/L PI的PBS 500 μl重懸，避光繼續(xù)孵育30 min，過200目細(xì)胞篩后。利用Guava easy Cyte 8微流式細(xì)胞分析儀檢測細(xì)胞周期。

1.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力

無血清培養(yǎng)基以8∶1的比例稀釋Matrigel膠，均勻鋪于Transwell小室，每孔50 μl，37℃反應(yīng)30 min。各組細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于Transwell小室，在含5%CO2的培養(yǎng)箱中37℃連續(xù)培養(yǎng)24 h。用濕棉棒擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞，然后揭下底部膜，底部向上晾干。最后移至載玻片上，用中性樹膠封片。顯微鏡下隨機(jī)取9個(gè)視野計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1HOTAIR在膠質(zhì)瘤細(xì)胞及正常膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)分析

qRT-PCR方法檢測正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800和膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172中HOTAIR mRNA的相對表達(dá)量。檢測結(jié)果顯示，HOTAIR mRNA在HA1800和A172中的表達(dá)量分別為1.12±0.08和2.67±0.03，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HOTAIR表達(dá)較正常星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著增加(P<0.01，圖1)。

2.2膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172中si-HOTAIR瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率檢測

利用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染24 h、48 h及72 h后HOTAIR mRNA的表達(dá)水平，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染si-HOTAIR后A172細(xì)胞中HOTAIR基因表達(dá)的抑制情況。結(jié)果顯示，NC組與Blank組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，si-HOTAIR組與NC組相比較，轉(zhuǎn)染24 h、48 h及72 h后A172細(xì)胞中HOTAIR mRNA的表達(dá)水平分別下降(38.27±3.52)%、(70.16±0.57)%和(81.54±0.41)%，有顯著性差異(P<0.01，圖2)。結(jié)果說明si-HOTAIR轉(zhuǎn)染顯著降低細(xì)胞中內(nèi)源表達(dá)的HOTAIR，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.3MTT法檢測si-HOTAIR對A172膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NC組與Blank組相比，轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h后細(xì)胞增殖率均無明顯變化(P>0.05)。si-HOTAIR組與Blank組相比，在轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞增殖率無明顯變化(P>0.05)，在轉(zhuǎn)染48 h和72 h后細(xì)胞增殖率分別下降(15.38±0.39)%(P<0.05)和(27.54±2.32)%(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖1HOTAIR在A172和HA1800中的表達(dá)結(jié)果圖2siHOTAIR瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A172細(xì)胞后HOTAIR的表達(dá)情況圖3HOTAIR表達(dá)量降低對A172膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測si-HOTAIR對膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-HOTAIR后，膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞逐漸增加，S期相對減少，且這一效果隨著時(shí)間的延長更加顯著(圖4)。結(jié)果表明，si-HOTAIR能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變。

2.5Transwell檢測si-HOTAIR對A172膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的影響

收集si-HOTAIR轉(zhuǎn)染48 h后的A172細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至Transwell小室繼續(xù)培養(yǎng)24 h，固定染色，顯微鏡下觀察。si-HOTAIR組穿過小室基底膜的紫色細(xì)胞數(shù)量明顯少于NC組及Blank組(圖5)。取9個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，Blank組、NC組及si-HOTAIR組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為76.8±2.4、71.2±5.6和36.1±1.5，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，si-HOTAIR組細(xì)胞侵襲能力顯著低于Blank組及NC組。結(jié)果表明，si-HOTAIR能夠降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。

3 討論

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，盡管其治療已發(fā)展為手術(shù)、放療和化療相結(jié)合的綜合治療模式，預(yù)后仍極差，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的中位生存期僅為14.6個(gè)月[5]。因此，更加深入的研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制是亟待解決的問題。越來越多的研究表明，IncRNA參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程，IncRNA可通過調(diào)節(jié)DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重構(gòu)等多種途徑，在膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色[6]。

HOTAIR是一種典型的IncRNA，也是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有反式轉(zhuǎn)錄作用的IncRNA，基因位于人類染色體12q13.13區(qū)同源框基因家族Hoxc11基因座的反義鏈。HOTAIR的生物學(xué)作用是通過募集一系列復(fù)雜蛋白復(fù)合體實(shí)現(xiàn)對下游靶標(biāo)癌基因和抑癌基因的調(diào)控，主要功能體現(xiàn)在調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的表觀遺傳，如調(diào)節(jié)H3K27me3組蛋白的修飾、調(diào)節(jié)PTEN基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平[7]。HOTAIR在乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、肝癌等多種腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，并且與臨床預(yù)后密切相關(guān)[8,9]。

圖4 HOTAIR表達(dá)量降低對細(xì)胞周期的影響

圖5 si-HOTAIR轉(zhuǎn)染后A172細(xì)胞侵襲能力檢測

HOTAIR在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮的具體作用目前尚不清楚，本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，對HOTAIR在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲中的作用進(jìn)行探討。首先利用qRT-PCR檢測到HOTAIR在膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172中的表達(dá)水平較正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800中明顯增高。為進(jìn)一步明確HOTAIR在膠質(zhì)瘤增殖和侵襲中的作用，我們采用siRNA沉默基因表達(dá)的方法，合成si-HOTAIR，利用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至A172細(xì)胞，qRT-PCR方法驗(yàn)證si-HOTAIR可以明顯下調(diào)HOTAIR的表達(dá)水平。采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測抑制HOTAIR的表達(dá)對人膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞增殖、周期及侵襲能力的影響。MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HOTAIR表達(dá)下調(diào)的A172膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖明顯受到抑制，細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)下調(diào)HOTAIR表達(dá)可以阻滯膠質(zhì)瘤細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換，同時(shí)，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)HOTAIR表達(dá)下調(diào)后A172細(xì)胞的侵襲能力明顯降低。

本研究結(jié)果表明，下調(diào)HOTAIR表達(dá)能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，HOTAIR有望成為膠質(zhì)瘤基因治療的潛在靶點(diǎn)。