李璟
摘 要:目的 探討右美托咪定減輕氧化應(yīng)激改善H9C2細胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用。方法 H9C2心肌細胞隨機分為三組,正常對照組(Control)、缺氧/復(fù)氧組(H/R)、Dex(5 μmol/L)干預(yù)H/R組。Dex干預(yù)H/R組先用Dex預(yù)處理6 h后,再經(jīng)缺氧/復(fù)氧處理。檢測各組細胞培養(yǎng)基中LDH的含量,CCK-8法檢測各組H9C2心肌細胞的存活率,試劑盒檢測caspase-3活性,試劑盒檢測MDA的含量和SOD活性。結(jié)果 與Control組相比,H/R組細胞活力降低,培養(yǎng)基中LDH含量增加,caspase-3活性增加,MDA含量升高而SOD活性降低,統(tǒng)計學(xué)意義顯著(P<0.01);Dex預(yù)處理提高H/R處理后的細胞活力,減少LDH含量和caspase-3活性,降低MDA含量,增加SOD活性,統(tǒng)計學(xué)意義顯著(P<0.01)。結(jié)論 Dex可通過減輕氧化應(yīng)激改善H9C2心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷。
關(guān)鍵詞:右美托咪定;氧化應(yīng)激;缺氧/復(fù)氧;H9C2
中圖分類號:R614 文獻標識碼:A DOI:10.3969/j.issn.1006-1959.2018.14.027
文章編號:1006-1959(2018)14-0095-03
Abstract:Objective To investigate the effect of dexmedetomidine on oxidative stress and improvement of hypoxia/reoxygenation injury in H9C2 cells.Methods H9C2 cardiomyocytes were randomly divided into three groups.The normal control group(Control), hypoxia/reoxygenation group(H/R),and Dex(5μmol/L)were used to intervene in the H/R group.Dex intervention in the H/R group was pretreated with Dex for 6 h and then treated with hypoxia/reoxygenation.The LDH content in the cell culture medium was detected. The survival rate of H9C2 cardiomyocytes in each group was detected by CCK-8 method.The caspase-3 activity was detected in the kit, and the MDA content and SOD activity were detected by the kit.Results Compared with the Control group,the cell viability in the H/R group decreased,the LDH content in the medium increased,the caspase-3 activity increased,the MDA content increased and the SOD activity decreased,statistically significant(P<0.01);Dex pretreatment improved cell viability after H/R treatment,decreased LDH content and caspase-3 activity,decreased MDA content,and increased SOD activity,with statistical significance(P<0.01).Conclusion Dex can alleviate hypoxia/reoxygenation injury of H9C2 cardiomyocytes by reducing oxidative stress.
Key words:Dexmedetomidine;Oxidative stress;Hypoxia/Reoxygenation;H9C2
缺血性心肌?。↖schemic cardiomyopathy,ICM)是世界范圍內(nèi)具有高致殘率和致死率的疾病,是目前威脅人類生命健康的一類主要疾病[1]??焖儆行У膶崿F(xiàn)缺血心肌的血液復(fù)流即再灌注,是臨床上首選的治療方法,然而再灌注本身會加重心肌損傷,導(dǎo)致能量代謝障礙,形成心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)[2-4]。關(guān)于MIRI機制的研究集中在鈣超載,氧化應(yīng)激,能量代謝障礙,炎癥反應(yīng)和凋亡、壞死及自噬等方面[5-7]。右美托咪定(dexmedetomidine, Dex)是一種新型的高選擇性α2受體激動劑,具有劑量依賴性的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮和抑制交感神經(jīng)興奮等作用,且對呼吸、循環(huán)的抑制作用輕微[8]。Dex對心肌的保護作用受到越來越多的關(guān)注,普遍認為Dex是通過抑制交感中樞活動,降低心率,降低心肌氧耗,改善心肌氧供需平衡,但具體機制仍未闡明。本研究采用H9C2細胞缺氧/復(fù)氧模型,觀察Dex預(yù)處理減輕氧化應(yīng)激改善H9C2細胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用。
1材料與方法
1.1試劑與儀器 H9C2心肌細胞系購買自深圳百恩維公司;鹽酸右美托咪定購自江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司(200 μg/2 ml);DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco公司;0.25 %胰蛋白酶購自Sigma公司;CCK-8細胞毒性檢測試劑盒購自七海生物公司;LDH檢測試劑盒,caspase-3活性檢測試劑盒,MDA檢測試劑盒和SOD檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備儀器廠;CO2細胞培養(yǎng)箱購自Thermo公司;低速離心機購自賽特湘儀公司;酶標儀購自SpectraMax公司。
1.2 H9C2心肌細胞的培養(yǎng)和H/R模型的建立 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育H9C2細胞;H/R模型通過將H9C2細胞正常培養(yǎng)基換為無血清的DMEM并在缺氧箱中處理12 h,之后將無血清的DMEM換成含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液后放入正常培養(yǎng)箱中孵育4 h。
1.3 實驗分組 將H9C2細胞隨機分為三組:正常對照組(Control)、缺氧/復(fù)氧組(H/R)和右美托咪定干預(yù)缺氧/復(fù)氧組(Dex+H/R)。Dex+H/R 組先用Dex預(yù)處理6 h,再進行H/R處理。
1.4 CCK-8法檢測各組細胞活力 各組實驗結(jié)束后,將培養(yǎng)基倒掉,用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次,再加入100 μl無血清的培養(yǎng)液和10 μl CCK-8檢測液,在37 ℃細胞培養(yǎng)箱中避光孵育2 h,酶標儀檢測各孔OD值,波長為450 nm。
1.5 各組細胞培養(yǎng)液中LDH的檢測 各組實驗結(jié)束后,收集每組培養(yǎng)瓶中細胞培養(yǎng)液,嚴格按照南京建成生物工程研究所提供的檢測試劑盒說明書操作,酶標儀檢測各孔OD值,波長為450 nm,將各組讀數(shù)與Control組比較。
1.6 caspase-3試劑盒檢測細胞凋亡 各組實驗結(jié)束后,加入試劑盒提供的裂解液,用細胞刮將各組細胞刮下,冰上裂解20 min,在12000 g離心力下離心15 min,收集上清,-80 ℃保存。嚴格按照試劑盒的說明,將蛋白樣品與底物混勻,37 ℃避光水浴1 h,于405 nm波長下,避光測定熒光底物吸光值。各組caspase-3活性的表示方法為:將對照組的活性設(shè)定為1,實驗組的caspase-3活性用其吸光值與對照組的比值表示。
1.7 各組細胞培養(yǎng)液中MDA含量和SOD活性的檢測 各組實驗結(jié)束后,收集每組培養(yǎng)瓶中細胞培養(yǎng)液,嚴格按照南京建成生物工程研究所提供的檢測試劑盒說明書操作,酶標儀檢測各孔OD值,波長為450 nm,按照說明書的方法將讀數(shù)換算為MDA和SOD的含量。
1.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,實驗結(jié)果用(x±s)表示,用單因素方差分析比較兩組之間的統(tǒng)計學(xué)差異,并用Bonferroni法進行校正,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義, P<0.01表示統(tǒng)計學(xué)意義顯著。
2結(jié)果
2.1 Dex對H/R損傷后H9C2細胞活力和培養(yǎng)基中LDH含量的影響 如圖1所示,與Control組相比,H9C2細胞H/R處理后降低了其細胞活力,培養(yǎng)基中LDH含量增加(P<0.01);而與H/R組相比,H9C2細胞Dex干預(yù)H/R細胞活力得到改善,培養(yǎng)基中LDH含量降低(P<0.01)。
2.2 Dex對H/R損傷后H9C2細胞凋亡的影響 如圖2所示,與Control組相比,H9C2細胞H/R處理后caspase-3的活性升高(P<0.01);而與H/R組相比,H9C2細胞Dex干預(yù)H/R后caspase-3的活性降低(P<0.01)。
2.3 Dex對H/R損傷后H9C2細胞氧化應(yīng)激的影響 如圖3所示,與Control組相比,H9C2細胞H/R處理后MDA含量升高,SOD活性降低(P<0.01);與H/R組相比,H9C2細胞Dex干預(yù)H/R后MDA含量降低,SOD活性升高(P<0.01)。
3 討論
心肌再灌注損傷已經(jīng)成為限制缺血性心臟病患者預(yù)后的重要因素,臨床上藥物溶栓、動脈搭橋術(shù)和經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)等的治療效果也大打折扣。如何有效減輕再灌注損傷一直是心血管研究領(lǐng)域的熱點和焦點。Dex作為一種新型的α腎上腺素受體高選擇性激動劑,被廣泛應(yīng)用于心血管手術(shù)的麻醉,并收到了很好的療效。
Dex預(yù)處理可激活α腎上腺素能受體,減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷。Dex還可能通過抑制mPTP的開放及線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel, mitoKATP)的活性減少心肌損傷[9]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),H/R組H9C2細胞活力顯著降低,培養(yǎng)基中LDH含量明顯增加,而Dex干預(yù)H/R組可顯著改善H9C2細胞活力,明顯降低培養(yǎng)基中LDH含量;caspase-3是caspase家族中關(guān)鍵的效應(yīng)分子,其活性增加是線粒體凋亡發(fā)生的重要標志[10]。同時,H/R組H9C2細胞caspase-3活性明顯增加,而Dex干預(yù)H/R組可顯著減少H9C2細胞凋亡,以上結(jié)果均說明Dex可減輕H9C2細胞H/R損傷。
氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心肌缺血-再灌注損傷的一個重要原因。本研究中發(fā)現(xiàn),H/R組H9C2細胞MDA含量明顯增加,SOD活性顯著降低,而Dex干預(yù)H/R組可顯著降低H9C2細胞MDA含量,增加SOD活性,這些結(jié)果說明Dex可通過降低氧化應(yīng)激改善H9C2細胞H/R損傷。
綜上所述,本研究證實Dex可通過降低氧化應(yīng)激減少細胞凋亡減輕心肌細胞缺血/再灌注損傷,發(fā)揮重要的心血管保護作用。本研究為臨床上應(yīng)用Dex作為防治圍術(shù)期心血管疾病提供了實驗依據(jù)。
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收稿日期:2018-4-25;修回日期:2018-5-4
編輯/李樺