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        右美托咪定減輕氧化應(yīng)激改善H9C2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷

        2018-10-30 10:17:44李璟
        醫(yī)學(xué)信息 2018年14期
        關(guān)鍵詞:缺氧復(fù)氧右美托咪定

        李璟

        摘 要:目的 探討右美托咪定減輕氧化應(yīng)激改善H9C2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用。方法 H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為三組,正常對(duì)照組(Control)、缺氧/復(fù)氧組(H/R)、Dex(5 μmol/L)干預(yù)H/R組。Dex干預(yù)H/R組先用Dex預(yù)處理6 h后,再經(jīng)缺氧/復(fù)氧處理。檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH的含量,CCK-8法檢測(cè)各組H9C2心肌細(xì)胞的存活率,試劑盒檢測(cè)caspase-3活性,試劑盒檢測(cè)MDA的含量和SOD活性。結(jié)果 與Control組相比,H/R組細(xì)胞活力降低,培養(yǎng)基中LDH含量增加,caspase-3活性增加,MDA含量升高而SOD活性降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著(P<0.01);Dex預(yù)處理提高H/R處理后的細(xì)胞活力,減少LDH含量和caspase-3活性,降低MDA含量,增加SOD活性,統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著(P<0.01)。結(jié)論 Dex可通過(guò)減輕氧化應(yīng)激改善H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷。

        關(guān)鍵詞:右美托咪定;氧化應(yīng)激;缺氧/復(fù)氧;H9C2

        中圖分類號(hào):R614 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A DOI:10.3969/j.issn.1006-1959.2018.14.027

        文章編號(hào):1006-1959(2018)14-0095-03

        Abstract:Objective To investigate the effect of dexmedetomidine on oxidative stress and improvement of hypoxia/reoxygenation injury in H9C2 cells.Methods H9C2 cardiomyocytes were randomly divided into three groups.The normal control group(Control), hypoxia/reoxygenation group(H/R),and Dex(5μmol/L)were used to intervene in the H/R group.Dex intervention in the H/R group was pretreated with Dex for 6 h and then treated with hypoxia/reoxygenation.The LDH content in the cell culture medium was detected. The survival rate of H9C2 cardiomyocytes in each group was detected by CCK-8 method.The caspase-3 activity was detected in the kit, and the MDA content and SOD activity were detected by the kit.Results Compared with the Control group,the cell viability in the H/R group decreased,the LDH content in the medium increased,the caspase-3 activity increased,the MDA content increased and the SOD activity decreased,statistically significant(P<0.01);Dex pretreatment improved cell viability after H/R treatment,decreased LDH content and caspase-3 activity,decreased MDA content,and increased SOD activity,with statistical significance(P<0.01).Conclusion Dex can alleviate hypoxia/reoxygenation injury of H9C2 cardiomyocytes by reducing oxidative stress.

        Key words:Dexmedetomidine;Oxidative stress;Hypoxia/Reoxygenation;H9C2

        缺血性心肌?。↖schemic cardiomyopathy,ICM)是世界范圍內(nèi)具有高致殘率和致死率的疾病,是目前威脅人類生命健康的一類主要疾病[1]??焖儆行У膶?shí)現(xiàn)缺血心肌的血液復(fù)流即再灌注,是臨床上首選的治療方法,然而再灌注本身會(huì)加重心肌損傷,導(dǎo)致能量代謝障礙,形成心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)[2-4]。關(guān)于MIRI機(jī)制的研究集中在鈣超載,氧化應(yīng)激,能量代謝障礙,炎癥反應(yīng)和凋亡、壞死及自噬等方面[5-7]。右美托咪定(dexmedetomidine, Dex)是一種新型的高選擇性α2受體激動(dòng)劑,具有劑量依賴性的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮和抑制交感神經(jīng)興奮等作用,且對(duì)呼吸、循環(huán)的抑制作用輕微[8]。Dex對(duì)心肌的保護(hù)作用受到越來(lái)越多的關(guān)注,普遍認(rèn)為Dex是通過(guò)抑制交感中樞活動(dòng),降低心率,降低心肌氧耗,改善心肌氧供需平衡,但具體機(jī)制仍未闡明。本研究采用H9C2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型,觀察Dex預(yù)處理減輕氧化應(yīng)激改善H9C2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用。

        1材料與方法

        1.1試劑與儀器 H9C2心肌細(xì)胞系購(gòu)買自深圳百恩維公司;鹽酸右美托咪定購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司(200 μg/2 ml);DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;0.25 %胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司;CCK-8細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自七海生物公司;LDH檢測(cè)試劑盒,caspase-3活性檢測(cè)試劑盒,MDA檢測(cè)試劑盒和SOD檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備儀器廠;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司;低速離心機(jī)購(gòu)自賽特湘儀公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自SpectraMax公司。

        1.2 H9C2心肌細(xì)胞的培養(yǎng)和H/R模型的建立 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育H9C2細(xì)胞;H/R模型通過(guò)將H9C2細(xì)胞正常培養(yǎng)基換為無(wú)血清的DMEM并在缺氧箱中處理12 h,之后將無(wú)血清的DMEM換成含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液后放入正常培養(yǎng)箱中孵育4 h。

        1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將H9C2細(xì)胞隨機(jī)分為三組:正常對(duì)照組(Control)、缺氧/復(fù)氧組(H/R)和右美托咪定干預(yù)缺氧/復(fù)氧組(Dex+H/R)。Dex+H/R 組先用Dex預(yù)處理6 h,再進(jìn)行H/R處理。

        1.4 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活力 各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,將培養(yǎng)基倒掉,用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次,再加入100 μl無(wú)血清的培養(yǎng)液和10 μl CCK-8檢測(cè)液,在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育2 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值,波長(zhǎng)為450 nm。

        1.5 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的檢測(cè) 各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,收集每組培養(yǎng)瓶中細(xì)胞培養(yǎng)液,嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所提供的檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作,酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值,波長(zhǎng)為450 nm,將各組讀數(shù)與Control組比較。

        1.6 caspase-3試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,加入試劑盒提供的裂解液,用細(xì)胞刮將各組細(xì)胞刮下,冰上裂解20 min,在12000 g離心力下離心15 min,收集上清,-80 ℃保存。嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明,將蛋白樣品與底物混勻,37 ℃避光水浴1 h,于405 nm波長(zhǎng)下,避光測(cè)定熒光底物吸光值。各組caspase-3活性的表示方法為:將對(duì)照組的活性設(shè)定為1,實(shí)驗(yàn)組的caspase-3活性用其吸光值與對(duì)照組的比值表示。

        1.7 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量和SOD活性的檢測(cè) 各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,收集每組培養(yǎng)瓶中細(xì)胞培養(yǎng)液,嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所提供的檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作,酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值,波長(zhǎng)為450 nm,按照說(shuō)明書的方法將讀數(shù)換算為MDA和SOD的含量。

        1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用(x±s)表示,用單因素方差分析比較兩組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,并用Bonferroni法進(jìn)行校正,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, P<0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

        2結(jié)果

        2.1 Dex對(duì)H/R損傷后H9C2細(xì)胞活力和培養(yǎng)基中LDH含量的影響 如圖1所示,與Control組相比,H9C2細(xì)胞H/R處理后降低了其細(xì)胞活力,培養(yǎng)基中LDH含量增加(P<0.01);而與H/R組相比,H9C2細(xì)胞Dex干預(yù)H/R細(xì)胞活力得到改善,培養(yǎng)基中LDH含量降低(P<0.01)。

        2.2 Dex對(duì)H/R損傷后H9C2細(xì)胞凋亡的影響 如圖2所示,與Control組相比,H9C2細(xì)胞H/R處理后caspase-3的活性升高(P<0.01);而與H/R組相比,H9C2細(xì)胞Dex干預(yù)H/R后caspase-3的活性降低(P<0.01)。

        2.3 Dex對(duì)H/R損傷后H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 如圖3所示,與Control組相比,H9C2細(xì)胞H/R處理后MDA含量升高,SOD活性降低(P<0.01);與H/R組相比,H9C2細(xì)胞Dex干預(yù)H/R后MDA含量降低,SOD活性升高(P<0.01)。

        3 討論

        心肌再灌注損傷已經(jīng)成為限制缺血性心臟病患者預(yù)后的重要因素,臨床上藥物溶栓、動(dòng)脈搭橋術(shù)和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)等的治療效果也大打折扣。如何有效減輕再灌注損傷一直是心血管研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。Dex作為一種新型的α腎上腺素受體高選擇性激動(dòng)劑,被廣泛應(yīng)用于心血管手術(shù)的麻醉,并收到了很好的療效。

        Dex預(yù)處理可激活α腎上腺素能受體,減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷。Dex還可能通過(guò)抑制mPTP的開放及線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel, mitoKATP)的活性減少心肌損傷[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),H/R組H9C2細(xì)胞活力顯著降低,培養(yǎng)基中LDH含量明顯增加,而Dex干預(yù)H/R組可顯著改善H9C2細(xì)胞活力,明顯降低培養(yǎng)基中LDH含量;caspase-3是caspase家族中關(guān)鍵的效應(yīng)分子,其活性增加是線粒體凋亡發(fā)生的重要標(biāo)志[10]。同時(shí),H/R組H9C2細(xì)胞caspase-3活性明顯增加,而Dex干預(yù)H/R組可顯著減少H9C2細(xì)胞凋亡,以上結(jié)果均說(shuō)明Dex可減輕H9C2細(xì)胞H/R損傷。

        氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心肌缺血-再灌注損傷的一個(gè)重要原因。本研究中發(fā)現(xiàn),H/R組H9C2細(xì)胞MDA含量明顯增加,SOD活性顯著降低,而Dex干預(yù)H/R組可顯著降低H9C2細(xì)胞MDA含量,增加SOD活性,這些結(jié)果說(shuō)明Dex可通過(guò)降低氧化應(yīng)激改善H9C2細(xì)胞H/R損傷。

        綜上所述,本研究證實(shí)Dex可通過(guò)降低氧化應(yīng)激減少細(xì)胞凋亡減輕心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷,發(fā)揮重要的心血管保護(hù)作用。本研究為臨床上應(yīng)用Dex作為防治圍術(shù)期心血管疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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        收稿日期:2018-4-25;修回日期:2018-5-4

        編輯/李樺

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