李璟

摘 要：目的 探討右美托咪定減輕氧化應(yīng)激改善H9C2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用。方法 H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為三組，正常對(duì)照組（Control）、缺氧/復(fù)氧組（H/R）、Dex（5 μmol/L）干預(yù)H/R組。Dex干預(yù)H/R組先用Dex預(yù)處理6 h后，再經(jīng)缺氧/復(fù)氧處理。檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH的含量，CCK-8法檢測(cè)各組H9C2心肌細(xì)胞的存活率，試劑盒檢測(cè)caspase-3活性，試劑盒檢測(cè)MDA的含量和SOD活性。結(jié)果 與Control組相比，H/R組細(xì)胞活力降低，培養(yǎng)基中LDH含量增加，caspase-3活性增加，MDA含量升高而SOD活性降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P<0.01）；Dex預(yù)處理提高H/R處理后的細(xì)胞活力，減少LDH含量和caspase-3活性，降低MDA含量，增加SOD活性，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P<0.01）。結(jié)論 Dex可通過減輕氧化應(yīng)激改善H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷。

關(guān)鍵詞：右美托咪定；氧化應(yīng)激；缺氧/復(fù)氧；H9C2

中圖分類號(hào)：R614 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.14.027

文章編號(hào)：1006-1959（2018）14-0095-03

Abstract：Objective To investigate the effect of dexmedetomidine on oxidative stress and improvement of hypoxia/reoxygenation injury in H9C2 cells.Methods H9C2 cardiomyocytes were randomly divided into three groups.The normal control group（Control）， hypoxia/reoxygenation group（H/R），and Dex（5μmol/L）were used to intervene in the H/R group.Dex intervention in the H/R group was pretreated with Dex for 6 h and then treated with hypoxia/reoxygenation.The LDH content in the cell culture medium was detected. The survival rate of H9C2 cardiomyocytes in each group was detected by CCK-8 method.The caspase-3 activity was detected in the kit， and the MDA content and SOD activity were detected by the kit.Results Compared with the Control group，the cell viability in the H/R group decreased，the LDH content in the medium increased，the caspase-3 activity increased，the MDA content increased and the SOD activity decreased，statistically significant（P<0.01）；Dex pretreatment improved cell viability after H/R treatment，decreased LDH content and caspase-3 activity，decreased MDA content，and increased SOD activity，with statistical significance（P<0.01）.Conclusion Dex can alleviate hypoxia/reoxygenation injury of H9C2 cardiomyocytes by reducing oxidative stress.

Key words：Dexmedetomidine；Oxidative stress；Hypoxia/Reoxygenation；H9C2

缺血性心肌?。↖schemic cardiomyopathy，ICM）是世界范圍內(nèi)具有高致殘率和致死率的疾病，是目前威脅人類生命健康的一類主要疾病[1]?？焖儆行У膶?shí)現(xiàn)缺血心肌的血液復(fù)流即再灌注，是臨床上首選的治療方法，然而再灌注本身會(huì)加重心肌損傷，導(dǎo)致能量代謝障礙，形成心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI）[2-4]。關(guān)于MIRI機(jī)制的研究集中在鈣超載，氧化應(yīng)激，能量代謝障礙，炎癥反應(yīng)和凋亡、壞死及自噬等方面[5-7]。右美托咪定（dexmedetomidine， Dex）是一種新型的高選擇性α2受體激動(dòng)劑，具有劑量依賴性的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮和抑制交感神經(jīng)興奮等作用，且對(duì)呼吸、循環(huán)的抑制作用輕微[8]。Dex對(duì)心肌的保護(hù)作用受到越來越多的關(guān)注，普遍認(rèn)為Dex是通過抑制交感中樞活動(dòng)，降低心率，降低心肌氧耗，改善心肌氧供需平衡，但具體機(jī)制仍未闡明。本研究采用H9C2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，觀察Dex預(yù)處理減輕氧化應(yīng)激改善H9C2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用。

1材料與方法

1.1試劑與儀器 H9C2心肌細(xì)胞系購(gòu)買自深圳百恩維公司；鹽酸右美托咪定購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司（200 μg/2 ml）；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；0.25 %胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司；CCK-8細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自七海生物公司；LDH檢測(cè)試劑盒，caspase-3活性檢測(cè)試劑盒，MDA檢測(cè)試劑盒和SOD檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備儀器廠；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司；低速離心機(jī)購(gòu)自賽特湘儀公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自SpectraMax公司。

1.2 H9C2心肌細(xì)胞的培養(yǎng)和H/R模型的建立 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育H9C2細(xì)胞；H/R模型通過將H9C2細(xì)胞正常培養(yǎng)基換為無血清的DMEM并在缺氧箱中處理12 h，之后將無血清的DMEM換成含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液后放入正常培養(yǎng)箱中孵育4 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將H9C2細(xì)胞隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組（Control）、缺氧/復(fù)氧組（H/R）和右美托咪定干預(yù)缺氧/復(fù)氧組（Dex+H/R）。Dex+H/R 組先用Dex預(yù)處理6 h，再進(jìn)行H/R處理。

1.4 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活力 各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將培養(yǎng)基倒掉，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，再加入100 μl無血清的培養(yǎng)液和10 μl CCK-8檢測(cè)液，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值，波長(zhǎng)為450 nm。

1.5 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的檢測(cè) 各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集每組培養(yǎng)瓶中細(xì)胞培養(yǎng)液，嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所提供的檢測(cè)試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值，波長(zhǎng)為450 nm，將各組讀數(shù)與Control組比較。

1.6 caspase-3試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，加入試劑盒提供的裂解液，用細(xì)胞刮將各組細(xì)胞刮下，冰上裂解20 min，在12000 g離心力下離心15 min，收集上清，-80 ℃保存。嚴(yán)格按照試劑盒的說明，將蛋白樣品與底物混勻，37 ℃避光水浴1 h，于405 nm波長(zhǎng)下，避光測(cè)定熒光底物吸光值。各組caspase-3活性的表示方法為：將對(duì)照組的活性設(shè)定為1，實(shí)驗(yàn)組的caspase-3活性用其吸光值與對(duì)照組的比值表示。

1.7 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量和SOD活性的檢測(cè) 各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集每組培養(yǎng)瓶中細(xì)胞培養(yǎng)液，嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所提供的檢測(cè)試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值，波長(zhǎng)為450 nm，按照說明書的方法將讀數(shù)換算為MDA和SOD的含量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用（x±s）表示，用單因素方差分析比較兩組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并用Bonferroni法進(jìn)行校正，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， P<0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2結(jié)果

2.1 Dex對(duì)H/R損傷后H9C2細(xì)胞活力和培養(yǎng)基中LDH含量的影響 如圖1所示，與Control組相比，H9C2細(xì)胞H/R處理后降低了其細(xì)胞活力，培養(yǎng)基中LDH含量增加（P<0.01）；而與H/R組相比，H9C2細(xì)胞Dex干預(yù)H/R細(xì)胞活力得到改善，培養(yǎng)基中LDH含量降低（P<0.01）。

2.2 Dex對(duì)H/R損傷后H9C2細(xì)胞凋亡的影響 如圖2所示，與Control組相比，H9C2細(xì)胞H/R處理后caspase-3的活性升高（P<0.01）；而與H/R組相比，H9C2細(xì)胞Dex干預(yù)H/R后caspase-3的活性降低（P<0.01）。

2.3 Dex對(duì)H/R損傷后H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 如圖3所示，與Control組相比，H9C2細(xì)胞H/R處理后MDA含量升高，SOD活性降低（P<0.01）；與H/R組相比，H9C2細(xì)胞Dex干預(yù)H/R后MDA含量降低，SOD活性升高（P<0.01）。

3 討論

心肌再灌注損傷已經(jīng)成為限制缺血性心臟病患者預(yù)后的重要因素，臨床上藥物溶栓、動(dòng)脈搭橋術(shù)和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)等的治療效果也大打折扣。如何有效減輕再灌注損傷一直是心血管研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。Dex作為一種新型的α腎上腺素受體高選擇性激動(dòng)劑，被廣泛應(yīng)用于心血管手術(shù)的麻醉，并收到了很好的療效。

Dex預(yù)處理可激活α腎上腺素能受體，減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷。Dex還可能通過抑制mPTP的開放及線粒體ATP敏感性鉀通道（mitochondrial ATP-sensitive potassium channel， mitoKATP）的活性減少心肌損傷[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H/R組H9C2細(xì)胞活力顯著降低，培養(yǎng)基中LDH含量明顯增加，而Dex干預(yù)H/R組可顯著改善H9C2細(xì)胞活力，明顯降低培養(yǎng)基中LDH含量；caspase-3是caspase家族中關(guān)鍵的效應(yīng)分子，其活性增加是線粒體凋亡發(fā)生的重要標(biāo)志[10]。同時(shí)，H/R組H9C2細(xì)胞caspase-3活性明顯增加，而Dex干預(yù)H/R組可顯著減少H9C2細(xì)胞凋亡，以上結(jié)果均說明Dex可減輕H9C2細(xì)胞H/R損傷。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心肌缺血-再灌注損傷的一個(gè)重要原因。本研究中發(fā)現(xiàn)，H/R組H9C2細(xì)胞MDA含量明顯增加，SOD活性顯著降低，而Dex干預(yù)H/R組可顯著降低H9C2細(xì)胞MDA含量，增加SOD活性，這些結(jié)果說明Dex可通過降低氧化應(yīng)激改善H9C2細(xì)胞H/R損傷。

綜上所述，本研究證實(shí)Dex可通過降低氧化應(yīng)激減少細(xì)胞凋亡減輕心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷，發(fā)揮重要的心血管保護(hù)作用。本研究為臨床上應(yīng)用Dex作為防治圍術(shù)期心血管疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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收稿日期：2018-4-25；修回日期：2018-5-4

編輯/李樺