俞嬌　施永勝　郭閃閃

[摘要] 目的 分析胸水細胞蠟塊結(jié)合免疫組織化學(xué)在肺腺癌中的應(yīng)用。 方法 收集東陽市中醫(yī)院2008年6月～2015年12月7年間50例可疑惡性胸水樣本，分析其臨床病史、涂片、細胞蠟塊切片、免疫組織化學(xué)及基因檢測等資料。 結(jié)果 50例可疑惡性胸水患者，增生反應(yīng)性間皮細胞4例，確診惡性腫瘤46例，其中肺腺癌27例，其他組織來源及組織類型19例，與細胞學(xué)常規(guī)涂片相比，細胞蠟塊切片鏡下可見背景干凈，染色對比清晰，細胞數(shù)目明顯增多、厚薄均勻，且可以尋找組織來源及基因檢測。 結(jié)論 細胞蠟塊結(jié)合免疫組織化學(xué)技術(shù)極大地提高了胸水細胞學(xué)的診斷準(zhǔn)確率及明確組織來源；同時為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療提供了平臺，值得推廣。

[關(guān)鍵詞] 胸水；免疫組織化學(xué)；腺癌；細胞塊

[中圖分類號] R734.2 [文獻標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2018）19-0135-04

Application of pleural effusion cell wax block combined with immunohistochemistry in advanced lung adenocarcinoma

YU Jiao1 SHI Yongsheng1 GUO Shanshan1 CHEN Yan2

1.Department of Pathology， Dongyang Traditional Chinese Medicine Hospital， Dongyang 322100， China； 2.Department of Pathology， Dongyang People's Hospital， Dongyang 322100， China

[Abstract] Objective To analyze the application of pleural effusion cell wax block combined with immunohistochemistry in lung adenocarcinoma. Methods 50 cases of suspected malignant pleural effusion from June 2008 to December 2015 were collected from Dongyang Traditional Chinese Hospital. The clinical history， smears， cell wax block， immunohistochemistry and gene detection were analyzed. Results There were 4 cases of proliferative reactive mesothelial cells and 46 cases of diagnosed malignant tumors in 50 cases of suspected malignant pleural effusion. Among them， 27 cases were lung adenocarcinoma and 19 cases were from other tissue sources and tissue types. Compared with that of cytological routine smears， the background of cell wax block was clean under the microscope， and the staining contrast was clear； the number of cells was obviously increased； the thickness was even； the tissue source and gene detection could be found. Conclusion The cell wax immunohistochemistry technique greatly improves the diagnostic accuracy of pleural effusion cytology and clarifies the source of tissue. At the same time， it provides a platform for accurate tumor treatment and is worthy of promotion.

[Key words] Pleural effusion； Immunohistochemistry； Adenocarcinoma； Cell mass

胸水細胞學(xué)樣本具有可多次重復(fù)取得、損傷小、檢查時間短等優(yōu)點，在臨床實際工作中較廣泛應(yīng)用于中晚期惡性腫瘤的檢查，而普通胸水細胞學(xué)涂片很難為臨床醫(yī)師提供惡性腫瘤的發(fā)病部位、腫瘤的病理組織學(xué)類型、預(yù)測預(yù)后以及與治療相關(guān)有價值的信息，甚至部分患者難以明確診斷。近年來隨著腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的不斷深入，應(yīng)用組織病理學(xué)樣本進行腫瘤基因或免疫組織化學(xué)腫瘤蛋白表達的檢測，已成為指導(dǎo)臨床靶向治療或預(yù)測化療藥物療效的最可靠方法之一，近年來特別是肺腺癌尤其有臨床指導(dǎo)意義，但對于晚期肺腺癌患者，常不容易取得組織病理學(xué)樣本，相較而言胸水細胞學(xué)樣本常較容易獲得，肺腺癌是導(dǎo)致惡性胸水的最常見原因之一，因此利用胸水細胞學(xué)樣本進行相應(yīng)的細胞蠟塊診斷及基因檢測、免疫組織化學(xué)檢測，對肺腺癌的診斷、指導(dǎo)臨床治療和預(yù)后具有重要意義。本文報告東陽市中醫(yī)院病理科應(yīng)用胸水細胞學(xué)樣本制作細胞蠟塊，在此基礎(chǔ)上進行免疫組織化學(xué)染色、對確診的晚期肺腺癌患者進行治療與預(yù)后相關(guān)的基因檢測，探討胸水細胞學(xué)樣本制作細胞蠟塊行免疫組織化學(xué)檢測在確定腫瘤組織的來源、腫瘤組織具體類型及肺腺癌患者的治療及預(yù)后的相關(guān)基因檢測中的應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集東陽市中醫(yī)院2008年6月～2015年12月7年間病理科歸檔具有常規(guī)涂片及細胞蠟塊資料的可疑惡性胸水細胞學(xué)樣本共50例，收集臨床病史、涂片、細胞蠟塊切片、免疫組織化學(xué)及基因檢測等資料，其中男29例，女21例，年齡40～79歲，平均（51.0±7.5）歲。

1.2 脫落細胞常規(guī)細胞學(xué)涂片

送檢的新鮮胸水細胞學(xué)樣本100 mL靜置15 min后，倒去上部清亮液體；取10～20 mL瓶底沉渣置于試管2500～3000轉(zhuǎn)/min離心5 min后，將上清液倒去；將剩余細胞學(xué)沉渣樣物0.5～1 mL用滴管混勻；用滴管吸取混勻的沉淀物滴在載玻片上，均勻涂片后在半潮干狀態(tài)下用4%甲醛固定10～30 min后常規(guī)蘇木素-伊紅染色；顯微鏡下仔細觀察。

1.3 細胞蠟塊操作方法

將胸水脫落細胞學(xué)樣本常規(guī)涂片細胞學(xué)檢查剩余的細胞學(xué)樣本移入20～50 mL離心管，2500～3000 轉(zhuǎn)/min，離心10 min，離心沉渣量太少的樣本移出上清液，多次重復(fù)加入細胞學(xué)樣本并離心，直到離心沉渣符合制作細胞蠟塊要求。離心管內(nèi)保留上清液1.5～2.5 mL，輕輕混勻，移入專用離心管，色澤較淺的標(biāo)本可適當(dāng)?shù)渭右良t試劑染色，靜置10 min后，放入水平式離心機1500～2000 轉(zhuǎn)/min，離心5 min（血性細胞學(xué)樣本，去除紅細胞后的離心沉渣仍含有較多血紅蛋白，需將離心時間延長1倍）；取出細胞塊收集環(huán)，細胞混懸液中的細胞成分被收集至細胞塊收集環(huán)中，形成固定大小形狀的固體細胞塊，從上部滴加1～2滴瓊脂液（已加熱至50℃～60℃），室溫冷卻，連同收集環(huán)用脫水紙包裹后放入脫水盒，4%中性甲醛固定液固定6～8 h以上，即可進入脫水機常規(guī)脫水處理，常規(guī)脫水、透明、浸蠟后包埋，切片行蘇木素-伊紅染色，免疫組織化學(xué)染色等。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測的選擇

根據(jù)胸水脫落細胞學(xué)涂片和胸水細胞蠟塊石蠟切片顯微鏡下觀察細胞學(xué)及細胞蠟塊形態(tài)學(xué)及臨床相關(guān)資料選擇免疫組織化學(xué)抗體，對于臨床及影像學(xué)可疑肺癌的患者，常規(guī)選擇AE1/AE3、TTF1、NapsinA、CK7、CK5/6、P63、P40、CEA作為肺癌抗體、選擇Calretinin、MC、D2-40、Vimentin作為間皮抗體。以上抗體均購置上海基因科技有限公司。

1.5 免疫組織化學(xué)

EnVision二步法，胸水細胞蠟塊石蠟切片，脫蠟至水，高壓抗原修復(fù)10 min，冷卻至室溫，充分水洗，磷酸鹽緩沖液（PBS）浸洗，3 min×3次；去除多余液體，加AE1/AE3、TTF1、NapsinA、CK7、CK5/6、P63、P40、CEA、Calretinin、MC、D2-40、Vimentin等一抗抗體，PBS浸洗，3 min×3次；去除多余液體，滴加通用型二抗-HRP聚合物，37℃，30 min；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色2 min，在顯微鏡下觀察顯色情況，蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸酒精分化，PBS沖洗返藍，乙醇脫水、透明、中性樹膠封固。

1.6 免疫組織化學(xué)判讀

根據(jù)染色程度和染色細胞百分率進行評定和分析，綜合考慮陽性細胞數(shù)和染色強度來判定結(jié)果，將其中（-）歸為陰性表達，（+）～（+++）歸為陽性表達。

1.7 肺腺癌治療與預(yù)后相關(guān)基因檢測

對于經(jīng)臨床病史及免疫組織化學(xué)確診肺腺癌27例中18例送杭州迪安醫(yī)學(xué)檢測中心進行表皮生長因子受體（EGFR）基因檢測。

2 結(jié)果

2.1 細胞學(xué)涂片

腺癌細胞明顯異型，多形性，核漿比高，核膜厚、不規(guī)則，核深染，染色質(zhì)粗塊狀，核仁大，有較強的三維立體結(jié)構(gòu)。50例可疑惡性胸水，11例診斷見退變異型細胞，無法明確性質(zhì)，39例診斷見惡性腫瘤細胞，其中15例傾向腺癌，24例組織類型難定。

2.2細胞蠟塊

50例可疑惡性胸水患者，增生反應(yīng)性間皮細胞4例，確診惡性腫瘤46例，其中肺腺癌27例，其他組織來源及組織類型19例，與細胞學(xué)涂片相比，細胞蠟塊制片鏡下觀察顯示背景干凈，染色對比清晰，細胞數(shù)目明顯富集、厚薄均勻，且在多數(shù)病例中可觀察到細胞的排列方式及組織學(xué)結(jié)構(gòu)可見中空的腺樣、囊泡狀、梁索一乳頭狀或片狀排列的細胞。見封三圖5。

2.3 免疫表型

綜合HE染色的細胞學(xué)涂片、細胞塊切片及臨床資料，不同的病例選用不同的抗體。肺腺癌病例中CK7、TTF1、NapsinA、CEA至少有兩項以上陽性，且Calretinin、CK5/6、D2-40、Vimentin均陰性。見封三圖6。

2.4 表皮生長因子受體（EGFR）檢測

27例肺腺癌送檢18例，其中5例有表皮生長因子受體（EGFR）突變，突變率27.8%。

3 討論

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，也是我國最常見的惡性腫瘤之一[1]。相當(dāng)數(shù)量的晚期肺癌患者來院就診的首發(fā)癥狀為大量惡性胸腔積液，因此對于一些通過臨床多種影像學(xué)檢查等手段均無法明確肺癌診斷的患者在指導(dǎo)治療、預(yù)測預(yù)后等方面非常重要。在所有肺癌胸腔轉(zhuǎn)移患者中，絕大多數(shù)為肺腺癌所致。傳統(tǒng)的胸腔積液檢查方法是收集胸腔積液行常規(guī)細胞學(xué)涂片，顯微鏡下僅憑借細胞形態(tài)學(xué)查找腫瘤細胞，但有時因涂片質(zhì)量欠佳，腫瘤細胞量少，涂片背景血細胞過多，且腫瘤細胞異型性不明顯或腫瘤細胞不典型，增生反應(yīng)性間皮細胞和轉(zhuǎn)移的肺腺癌細胞形態(tài)極為相似時，易導(dǎo)致腫瘤的誤診或漏診[2]。臨床實際工作中，鑒別肺轉(zhuǎn)移性腫瘤和間皮性病變具有較大意義，特別是鑒別肺腺癌和惡性間皮瘤常直接影響治療方案的制定[3]。細胞蠟塊因?qū)⑹占募毎麑W(xué)樣本做成細胞塊石蠟切片而具有組織學(xué)的優(yōu)點，該技術(shù)用于免疫組織化學(xué)研究胸腔積液不僅有利于明確診斷且可以查找腫瘤原發(fā)灶及組織類型[4]。張小偉等[5]利用42例惡性漿膜腔積液標(biāo)本制作細胞蠟塊結(jié)合免疫組織化學(xué)檢查明確組織類型及腫瘤原發(fā)病灶40例，其中肺癌29例（腺癌24例、鱗癌3例、小細胞癌2例），其他組織類型及組織來源惡性腫瘤11例。閻紅琳等[6]分析53例可疑惡性漿膜腔積液樣體制作細胞蠟塊結(jié)合免疫組織化學(xué)最終明確診斷惡性腫瘤50例，其中肺腺癌31例，消化道腺癌3例，乳腺癌2例，卵巢、輸卵管及腹膜3例，肺鱗狀細胞癌2例，其他惡性腫瘤9例。本組研究根據(jù)臨床提供的患者病史，選擇不同的免疫組織化學(xué)抗體組合，對50例可疑惡性胸腔積液樣本進行標(biāo)記，確診增生反應(yīng)性間皮細胞4例，確診惡性腫瘤46例，其中肺腺癌27例，其他組織來源及組織類型19例。肺腺癌CK7、TTF1、NapsinA、CEA至少有兩項以上陽性，且Calretinin、CK5/6、D2-40、Vimentin均陰性，TTF1及NapsinA在診斷肺腺癌有具有較好的敏感性和特異性[7-8]。羅巧明等[9]研究認(rèn)為聯(lián)合檢測TTF-1、CA125、CK7、CK20能有效鑒別漿膜腔積液中來自肺、卵巢、胃腸道的腺癌。

腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療己逐漸成為肺腺癌治療的新方向[10]，近年來表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）為肺腺癌患者的治療帶來了新的靶向治療手段，研究發(fā)現(xiàn)用吉非替尼治療后的晚期肺腺癌患者的生存期明顯延長，但用藥前必須進行表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）的突變檢測[11-13]。對穿刺活檢獲取組織病理學(xué)樣本進行突變檢測困難，但又迫切希望進行個體化治療的晚期肺腺癌患者，胸腔積液細胞蠟塊可作為一種較好的且可能是唯一的檢測樣本來源[14]。沈湘萍等[15]分析45例疑似惡性胸腔積液樣本進行制作細胞蠟塊切片發(fā)現(xiàn)胸腔積液沉渣包埋切片及免疫組織化學(xué)可作為惡性胸腔積液診斷的重要手段，并可為臨床尋找和判斷惡性腫瘤細胞組織來源及組織類型提供幫助。張麗華等[16]分析64例惡性細胞學(xué)樣本發(fā)現(xiàn)利用細胞學(xué)剩余樣本制備細胞蠟塊，結(jié)合免疫組織化學(xué)標(biāo)記物和基因檢測技術(shù)有助于晚期惡性腫瘤的診斷，并為個體化治療方案的選擇提供可靠依據(jù)。本組研究中27例肺腺癌送檢表皮生長因子受體（EGFR）檢測18例，其中有表皮生長因子受體（EGFR）基因突變5例，突變率27.8%，與以往文獻報道相近[17-18]。

總之，細胞蠟塊免疫組織化學(xué)技術(shù)極大地提高了胸水細胞學(xué)的診斷準(zhǔn)確率；同時為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療提供了平臺，值得推廣[19]。惡性胸水細胞塊行免疫組織化學(xué)檢測不僅有助于腫瘤的明確診斷，更有助于對腫瘤進行分類并判斷腫瘤原發(fā)部位及幫助判斷預(yù)后，利用胸水細胞蠟塊可以對肺腺癌進行表皮生長因子受體（EGFR）基因突變的檢測，為肺腺癌的基因檢測提供新型的樣本來源[20]。

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（收稿日期：2017-10-18）