楊亞威 ，楊明明，龔月生

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

枯草芽孢桿菌雖為益生菌[1]，但其在動物腸道中停留時間短暫且易被機(jī)體降解，而芽孢能有效抵抗胃腸道中的酸堿環(huán)境，因此延長芽孢在腸道中的停留時間能夠有效地發(fā)揮枯草芽孢桿菌的益生特性。

在環(huán)境惡劣，營養(yǎng)缺乏等極端條件下，枯草芽孢桿菌屬的營養(yǎng)細(xì)胞會形成一種休眠體，即芽孢?？莶菅挎邨U菌的芽孢包括中心內(nèi)核和幾種蛋白層結(jié)構(gòu)，內(nèi)核主要由高度失水的基因組構(gòu)成，蛋白層結(jié)構(gòu)由至少70種蛋白質(zhì)組成，由內(nèi)到外分為皮質(zhì)層、基底層、芽孢內(nèi)殼、芽孢外殼和crust層[2](圖1)。

圖1 芽孢外殼結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure diagram of spore coat

芽孢用釕紅染色后在電鏡下能觀察到crust層[3]，外殼蛋白層主要有保護(hù)芽孢的作用，使其免受各種蛋白酶、有毒物質(zhì)和惡劣環(huán)境因子等的影響。

在芽孢表面展示高粘附因子能夠增強(qiáng)芽孢粘附腸道細(xì)胞的能力，但絕大多數(shù)已經(jīng)報道的研究常采用異位整合的方式實現(xiàn)外源蛋白與芽孢衣殼蛋白的融合表達(dá)，表達(dá)效率低[4]。本研究嘗試?yán)迷徽系姆椒?gòu)建一套芽孢表面展示載體，尋找一種新的芽孢表面展示方法，選用兩種芽孢衣殼蛋白CotB和CotZ作錨定蛋白，通過原位整合的方式嘗試實現(xiàn)綠色熒光蛋白在枯草芽孢桿菌芽孢表面的展示。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 引物、菌株、質(zhì)粒和主要試劑 大腸桿菌(E.coliDH5α)和枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisPY79)為本實驗室保存，分別作為克隆宿主菌和表達(dá)宿主菌。攜帶有綠色熒光蛋白編碼基因的質(zhì)粒pEYW24為本實驗室保存。各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、pGEM T-easy載體購自美國Promega公司；普通Taq DNA聚合酶、基因組提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、PCR純化回收試劑盒等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)MEGA，兔源GFP抗體及羊抗兔二抗購自西安嘉城生物科技有限公司。用于擴(kuò)增外殼蛋白編碼基因引物見表1，用于擴(kuò)增芽孢衣殼蛋白編碼基因的下游引物均不含終止密碼子。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primers and sequences

1.1.2 培養(yǎng)基 大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均用普通LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，在需要時分別加入氨芐青霉素(100 μg/mL)和壯觀霉素(50 μg/mL)。

1.2 方法

1.2.1 原位整合型重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以BacillussubtilisPY79基因組為模板，分別以BPcotB-up和BPcotBgggs,BPcotZ-up和BPcotZgggs為引物，擴(kuò)增芽孢衣殼蛋白基因(在上游加入了BamHⅠ酶切位點，下游加入了GGGS連結(jié)肽)，體系回收PCR產(chǎn)物，再以PCR產(chǎn)物為模板，BPcotB-up/down，BPcotZ-up/down為引物擴(kuò)增芽孢衣殼蛋白基因(在下游加入PstⅠ酶切位點)，體系回收PCR產(chǎn)物。上述PCR產(chǎn)物純化后連接于pGEM T easy，酶切鑒定正確后送樣測序。以BamHⅠ和PstⅠ酶切與pGEM T easy連接的兩種重組質(zhì)粒，以PstⅠ和SacⅠ酶切質(zhì)粒pEYW24，回收cotB、cotZ和gfp片段，克隆于枯草芽孢桿菌整合型質(zhì)粒pLX-2上，得到重組質(zhì)粒pEYW25和pEYW26，構(gòu)建流程圖見圖2。

圖2 原位整合載體pEYW25和pEYW26的構(gòu)建流程 cotB,cotZ為芽孢外殼蛋白編碼基因；ColE為大腸桿菌復(fù)制子；MCS為多克隆酶切位點； Spec為壯觀霉素抗性基因；gfp為綠色熒光蛋白編碼基因Fig.2 Flow diagram of construction strategy for single crossover integration vectors pEYW25 and pEYW26 cotB,cotZ：the coding genes of spore coat protein；ColE：replicon of E.coli；MCS：abbreviation of multiple cloning site；Spec：Spectinomycin resistance gene；gfp：the coding gene of green fluorescence protein

1.2.2 原位整合型重組菌的構(gòu)建 將鑒定正確的整合型重組質(zhì)粒pEYW25和pEYW26轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，質(zhì)粒上帶有的基因片段cotB和cotZ與枯草芽孢桿菌基因組上的同源片段發(fā)生單交叉同源重組，整個質(zhì)粒被線性化地整合到染色體上(圖3)。

1.2.3 分子生物學(xué)操作 DNA的酶切、連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌均按照分子克隆實驗指南第三冊的方法進(jìn)行，質(zhì)粒DNA的提取，酶切產(chǎn)物回收均按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.2.4 枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化 采用Spizizen法[5]制備BacillussubtilisPY79感受態(tài)細(xì)胞，-80 ℃保存。轉(zhuǎn)化時將感受態(tài)細(xì)胞于45 ℃融化，加入適量的DNA，37 ℃，80 r/min培養(yǎng)30 min，將感受態(tài)細(xì)胞涂布在含壯觀霉素的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)后進(jìn)行篩選鑒定。

圖3 重組菌BSYW25和BSYW26的構(gòu)建流程圖 cotB,cotZ為芽孢外殼蛋白編碼基因；ColE為大腸桿菌復(fù)制子；MCS為多克隆酶切位點； Spec為壯觀霉素抗性基因；gfp為綠色熒光蛋白編碼基因Fig.3 Flow diagram of construction strategy for recombinant strains BSYW25 and BSYW26 cotB,cotZ：the coding genes of spore coat protein；ColE：replicon of E.coli； Spec：Spectinomycin resistance gene；gfp：the coding gene of green fluorescence protein

1.2.5 枯草芽孢桿菌芽孢的制備及芽孢衣殼蛋白的提取 采用營養(yǎng)耗盡法[6]誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌生孢，5 000 r/min離心10 min收集芽孢，重懸于1 mL無菌水中，加入終濃度為2 mg/mL的溶菌酶37 ℃處理1 h殺死營養(yǎng)體細(xì)胞，離心取上清，1 mL無菌水重懸。

取芽孢懸浮液離心去上清，加入適量的SDS-DTT溶液，37 ℃水浴保溫2 h，用pH 8.0的1 mol/L Tris-HCl緩沖液洗滌數(shù)次，芽孢用等體積的裂解緩沖液重懸，置于冰上超聲破碎，低溫下8 500 r/min離心20 min收集芽孢，沉淀用PBS重懸。

1.2.6 枯草芽孢桿菌芽孢的顯微拍攝 取10 μL芽孢懸浮液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于NIKON正置熒光顯微鏡Ni-U載物臺上，將激發(fā)光調(diào)至藍(lán)光檔觀察綠色熒光，利用NIS-Elements圖像處理軟件中的Color DS-Ri2調(diào)整曝光時間，在100倍油鏡下觀察熒光。

1.2.7 Western blot 分析 取200 μL的芽孢外殼蛋白提取液，加入等體積的上樣緩沖液，95 ℃水浴10 min，10 000 r/min離心10 min取上清進(jìn)行SDS-PAGE，電泳完畢后，將分離膠浸在TBST轉(zhuǎn)膜緩沖液5～10 min，電轉(zhuǎn)采用恒流電轉(zhuǎn)，電流大小由膜面積而定。電轉(zhuǎn)使蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后將膜在封閉液中封閉1 h，加入兔源GFP一抗，室溫反應(yīng)2 h，再加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，用HRP-DAB底物試劑盒進(jìn)行顯色反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 原位整合型重組質(zhì)粒的構(gòu)建

BamHⅠ和SacⅠ酶切鑒定質(zhì)粒pEYW25和pEYW26，分別出現(xiàn)大小約為1.5 kb，1.3 kb的目的條帶和1.8 kb大小的載體片段，與預(yù)期結(jié)果一致，表明含有融合基因cotB-gfp和cotZ-gfp的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，結(jié)果如圖4。

圖4 質(zhì)粒pEYW25和pEYW26酶切鑒定 1,4:EcoRⅠ和SacⅠ雙酶切質(zhì)粒pEYW25, pEYW26; 2:Trans 1 Kb DNA Ladder；3:Trans 2Kb Plus DNA LadderFig.4 pEYW25 and pEYW26 digested by restriction enzyme 1,4:pEYW25 and pEYW26 digested by EcoRⅠ and SacⅠ; 2:Trans 1Kb DNA Ladder; 3:Trans 2Kb Plus DNA Ladder

2.2 融合表達(dá)CotB-GFP、CotZ-GFP的原位整合型重組菌的構(gòu)建

分別用BPcotB-up/down，PSGfp-up/down，BPcotB-up和PSGfp-down驗證cotB-gfp片段是否插入染色體中，用BPcotZ-up/down，PSGfp-up/down，BPcotZ-up和PSGfp-down驗證cotZ-gfp片段是否插入染色體中，PCR鑒定結(jié)果如圖5，分別出現(xiàn)了大小約為800 bp的cotB，750 bp的gfp，1.5 kb的cotB-gfp，600 bp的cotZ，750 bp的gfp，1.3 kb的cotZ-gfp的目的條帶，證明融合片段成功地整合到染色體中，每個融合基因的轉(zhuǎn)錄都受自身啟動子的調(diào)控。鑒定正確的菌種分別命名為BSYW25和BSYW26。

圖5 重組菌BSYW25和BSYW26基因組的PCR鑒定

4:Trans 1 Kb DNA Ladder；8,21: Trans 2K Plus DNA Ladder；1,2,3:分別以ddH2O,BacillussubtilisPY79,BSYW25 genome為模板，以BPcotB-up/PSGfp-down為引物對融合基因片段cotB-gfp的擴(kuò)增產(chǎn)物；5,6,7:分別以ddH2O,BacillussubtilisPY79,BSYW25 genome為模板，以PSGfp-up/down為引物對基因片段gfp的擴(kuò)增產(chǎn)物；9,10,11：分別以ddH2O,BacillussubtilisPY79,BSYW25 genome為模板，BPcotB-up/down為引物對基因片段cotB的擴(kuò)增產(chǎn)物；12,13,14：分別以BacillussubtilisPY79, ddH2O, BSYW26 genome為模板，BPcotZ-up/PSGfp-down為引物對融合基因片段cotZ+gfp的擴(kuò)增產(chǎn)物；15,16,17：分別以BacillussubtilisPY79,ddH2O,BSYW26 genome為模板，PSGfp-up/down為引物對基因片段gfp的擴(kuò)增產(chǎn)物；18,19,20：分別以BacillussubtilisPY79,ddH2O,BSYW26 genome為模板，BPcotZ-up/down為引物對基因片段cotZ的擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig.5 PCR-amplificated production of recombinant strain BSYW25 and BSYW26

4:Trans 1 Kb DNA Ladder;8,21:Trans 2 K Plus DNA Ladder;1,2,3:Amplification of fusion gene fragmentcotB-gfpusing ddH2O,BacillussubtilisPY79, BSYW25 genome as template and BPcotB-up/PSGfp-down as primer;5,6,7:Amplification of gene fragment gfp using ddH2O,BacillussubtilisPY79, BSYW25 genome as template and PSGfp-up/down as primer;9, 10,11:Amplification of gene fragment cotB using ddH2O,BacillussubtilisPY79,BSYW25 genome as template and BPcotB-up/down as primer;12,13,14:Amplification of fusion gene fragmentcotZ-gfpusingBacillussubtilisPY79,ddH2O,BSYW26 genome as template and BPcotZ-up/PSGfp-down as primer;15,16,17: Amplification of gene fragment gfp usingBacillussubtilisPY79,ddH2O,BSYW26 genome as template and PSGfp-up/down as primer;18,19,20:Amplification of gene fragmentcotZ

usingBacillussubtilisPY79,ddH2O,BSYW26 genome as template and BPcotZ-up/down as primer

2.3 重組菌BSYW25和BSYW26芽孢表面展示GFP的鑒定

將鑒定正確的重組菌BSYW25和BSYW26按1:50～100的比例接種于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別在24 h和48 h取菌液，制備芽孢在熒光顯微鏡下觀察，以BacillussubtilisPY79為對照。培養(yǎng)20 h的重組菌和BacillussubtilisPY79均為營養(yǎng)細(xì)胞，檢測不到熒光信號(結(jié)果未顯示)，培養(yǎng)48 h的重組菌和BacillussubtilisPY79大部分為芽孢，BSYW26在熒光顯微鏡下能觀察到熒光，而BSYW25和BacillussubtilisPY79均不能觀察到熒光，結(jié)果如圖6。

2.4 Western blot檢測重組菌芽孢表面展示的GFP

為了進(jìn)一步驗證GFP是否被錨定在重組菌芽孢上，Western blot分析重組菌芽孢外殼蛋白提取液，以BacillussubtilisPY79的芽孢外殼蛋白為對照，結(jié)果見圖7，重組菌BSYW26的芽孢中出現(xiàn)大小約為55 kDa的目的條帶(CotZ-GFP融合蛋白，條帶1和2)，對照組沒有出現(xiàn)對應(yīng)的目的條帶(條帶3和4)，表明GFP錨定在了重組菌芽孢上。

圖6 重組菌芽孢表面GFP的熒光檢測(10×100 油鏡) a,b:分別為重組菌BSYW26在熒光和白光下；c,d:分別為重組菌Bacillus subtilis PY79在熒光和白光下Fig.6 Detection of GFP on spore surface of recombinant strain(10×100 oil lens) a,b:spores of recombinant strain BSYW26 under fluorescence and visible light;c,d:spores of Bacillus subtilis PY79 under fluorescence and visible light

圖7 Western blot 分析重組菌BSYW26芽孢表面GFP 1，2.重組菌BSYW26；3，4.Bacillus subtilis PY79Fig. 7 Analysis of GFP on spore of recombinant strain BSYW26 by Western blot 1，2. the spore of recombinant strain BSYW26; 3，4. the spore of Bacillus subtilis PY79

3 討 論

影響枯草芽孢桿菌芽孢表面展示效率的因素包括：目的蛋白的表達(dá)量、穩(wěn)定性和屬性；錨定蛋白的定植位點和特性；錨定蛋白與目的蛋白的連接方式；表達(dá)載體和宿主菌的類型等。錨定蛋白的選擇在芽孢表面展示的成功中起著關(guān)鍵作用，因為錨定蛋白的定植位置和特性影響芽孢表面展示的效率，同一種目的蛋白通過不同的錨定蛋白來展示，其最終的展示效率存在很大差異，Hinc等[7]利用芽孢外殼蛋白CotB、CotC和CotG來展示外源蛋白UreA，結(jié)果表明外殼蛋白CotC的展示效率最高。Wang等[8]利用Crust層蛋白CotY和CotZ展示外源蛋白β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，結(jié)果顯示CotZ展示β-半乳糖苷酶的效率明顯高于CotY。Hinc等[9]在外殼蛋白的編碼基因cotB的3'端分別使用兩種不同的連結(jié)肽(GGGGS和GGGEAAAKGG G)與UreA編碼基因的5'端融合，結(jié)果顯示CotB-GGGGS-UreA融合蛋白無法成功地展示在枯草芽孢桿菌芽孢表面，原因可能為短的連結(jié)肽沒能形成二級結(jié)構(gòu)，不能有效地穩(wěn)定融合蛋白的結(jié)構(gòu)，而較長的連結(jié)肽GGGEAAAKGGG在融合蛋白翻譯后修飾的過程中可以形成穩(wěn)定的α螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能有效地提高表面展示的效率，Negri等[10]在相關(guān)的研究中也得出同樣的結(jié)果。目的蛋白的大小和屬性是決定展示成功的決定因素，當(dāng)展示的目的蛋白較大且比較復(fù)雜時芽孢表面展示則可能失敗[11]。

枯草芽孢桿菌芽孢外殼蛋白CotB和CotZ已在研究中被證實能夠用于展示外源蛋白[7-8，12-14]，Imamura等[2]利用抗GFP抗體證明了蛋白CotZ位于Crust層，CotB位于outer coat層并且抗體無法與CotB-GFP蛋白結(jié)合，通過cotZ的敲除證明外殼蛋白CotZ在Crust層蛋白沉積在芽孢周圍的過程中起關(guān)鍵作用，cotZ基因的缺失會導(dǎo)致Crust層蛋白在芽孢周圍分布不均勻。cotB基因的缺失則對outer coat 層的形成沒有影響，但是否影響融合蛋白CotB-GFP的沉積過程還需進(jìn)一步驗證。上述大部分研究均采用淀粉酶基因位點異位整合的方式，而有關(guān)原位整合方式在枯草芽孢桿菌芽孢表面展示應(yīng)用的報道較少。原位整合與異位整合的不同在于原位整合可使芽孢衣殼蛋白編碼基因的閱讀框被破壞，相應(yīng)地，使得芽孢衣殼蛋白的合成受阻，重組菌內(nèi)合成的融合蛋白在生孢過程中的定植可能出現(xiàn)紊亂，造成表面展示的失敗。

本研究采用原位整合的方式，外殼蛋白的結(jié)構(gòu)被破壞，這能初步證明外殼蛋白的破壞是否影響相應(yīng)融合蛋白的展示。重組菌BSYW26芽孢表面能檢測到熒光表明CotZ蛋白的破壞沒有影響融合蛋白CotZ-GFP在芽孢表面的展示。而重組菌BSYW25芽孢表面展示GFP蛋白的失敗則可能存在兩方面原因：第一，由于各種芽孢外殼蛋白在裝備到芽孢表面的過程中存在“優(yōu)先性”，融合蛋白CotB-GFP在這一過程中則可能被蛋白酶降解，進(jìn)而導(dǎo)致表面展示的失??；第二，融合蛋白CotB-GFP之間的連結(jié)肽較短，不能形成有效的二級結(jié)構(gòu)，融合蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。

4 結(jié) 論

本研究表明，原位整合的方式能使芽孢的Crust層蛋白CotZ作為錨定蛋白展示外源蛋白，而芽孢的Outer coat 層蛋白CotB在芽孢表面展示方面的應(yīng)用還需進(jìn)一步的改進(jìn)。