★ 楊元豐 劉鑫 譚舒舒 楊武亮

(江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004)

女貞子為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit的干燥成熟果實(shí)。其性味甘、苦、涼，歸肝、腎經(jīng)。具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)的功效[1]。《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列之為上品，謂其“味苦平，主補(bǔ)中，安五臟，養(yǎng)精神，除百病”[2]。女貞子中主要含有萜類[3]、黃酮類[4]、苯乙醇類、多糖[5]等化學(xué)成分。近代藥理研究表明女貞子具有抗炎、降血糖、保肝、抗衰老、抗癌及抗腫瘤等作用，并能提高免疫功能[6]。其中齊墩果酸(Oleanolic acid，OA)和熊果酸(Ursohc acid，UA)是女貞子中主要脂溶性成分，兩者屬五環(huán)三萜類化合物，結(jié)構(gòu)極為相似。

齊墩果酸毒性很低，具有多種生物活性：抗病毒、消炎、增強(qiáng)免疫和免疫調(diào)解、抑制血小板凝集、降血脂、降糖、保肝、護(hù)腎、抗艾滋病毒等作用[7-9]熊果酸毒性小，具有多種生物學(xué)活性，尤其是在抗腫瘤、抗氧化、保肝、降血脂方面作用顯著[10-12]。表明齊墩果酸和熊果酸是為女貞子的活性成分。2015年版《中國藥典》規(guī)定女貞子在冬季果實(shí)成熟時采收，又因女貞分布地域廣，各地果實(shí)成熟時間差異較大，其活性成分含量是否因女貞子采收期不同而受到影響。清代·汪昂的《醫(yī)方集解》(刊于1682年)在對“二至丸”的制法記載中，對女貞子采集時間的要求“冬青子(即女貞子) 冬至日采……旱蓮草夏至日采”[13]。是否女貞子應(yīng)在冬至前后采收，未見文章報(bào)道。本文建立同時測定齊墩果酸和熊果酸含量的高效液相色譜方法，并對江西省南昌市灣里區(qū)江西中醫(yī)藥大學(xué)校園內(nèi)不同采收時期的女貞子進(jìn)行含量測定，研究兩種萜類成分含量的動態(tài)變化，為指導(dǎo)當(dāng)?shù)嘏懽拥牟墒掌诩捌鋺?yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀(自動進(jìn)樣器：G1329B;四元泵：G1311C；柱溫箱：G1316A；DAD檢測器：G4212B；Agilent色譜工作站)。萬分之一天平(德國，Sartorius BT224s)；十萬分之一天平(德國，Sartorius BT25s)；色譜柱：Dikma Diamonsil C18(150mm×4.6mm，5μm)。

齊墩果酸(批號：110709-201206)，熊果酸(批號：110742-201421)對照品均購于中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用。乙腈(HPLC級，美國Tedia公司)；其它試劑均為分析純，水為雙蒸水。

女貞子藥材于冬至前后采于江西南昌灣里區(qū)江西中醫(yī)藥大學(xué)校園內(nèi)(共12批，編號1～12)的同一棵女貞樹，每隔1星期采集一次，采集時間見表7，并經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)科組賴學(xué)文副教授鑒定為木犀科植物女貞(LigustrumlucidumAit)的果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 分別取齊墩果酸、熊果酸對照品適量，精密稱定，分別置25mL容量瓶中，加甲醇定容，得到每1mL分別含0.3536mg齊墩果酸與0.3440mg熊果酸的溶液，搖勻，即得齊墩果酸和熊果酸對照品各自的貯備液，備用。

2.2 供試品溶液的制備 取女貞子干燥粉末(過三號篩)約1.0g，精密稱定，加甲醇50mL，稱重，水浴加熱回流60min，放置室溫，再稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的量，搖勻，經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱 Dikma Diamonsil C18(150mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈∶甲醇∶水(1000mL含2mL磷酸和4mL三乙胺)=50∶33∶17；流速:1mL/min，進(jìn)樣量：10μL，檢測波長：205nm；柱溫：30℃。色譜圖見圖1。

A：混合對照品；B：樣品；C：甲醇溶劑；1.齊墩果酸；2.熊果酸

2.4 線性范圍考察 分別精密吸取上述齊墩果酸對照品貯備液7.5mL、熊果酸對照品貯備液2.5mL，同置于10mL容量瓶中，得到分別含0.2652mg/mL的齊墩果酸和0.086mg/mL熊果酸的混合對照品溶液。采用自動進(jìn)樣方法，精密吸取2，4，6，8，10，12，14μL進(jìn)樣，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。齊墩果酸、熊果酸的回歸方程分別為:Y=530.01X-16.28(r=0.9993)和Y=520.111X+2.4739(r=0.9990)，表明齊墩果酸、熊果酸分別在0.5304～3.7128μg 和0.1720～1.2040μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述混合對照品溶液10μL，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得齊墩果酸、熊果酸峰面積RSD值分別為1.47%和1.77%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(女貞子6號，含齊墩果酸1.88%，熊果酸0.18%)，分別于0，2，4，6，8，10，12h后進(jìn)樣，測得齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD分別為0.42%和1.75%，結(jié)果表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一樣品6份(女貞子6號)，按供試品溶液制備方法分別制備6份供試品溶液，進(jìn)樣，測得齊墩果酸和熊果酸含量，計(jì)算其RSD，分別為0.20%和1.43%，結(jié)果表明方法的重復(fù)性好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的女貞子樣品(女貞子6號)6份，每份0.5g，加入一定量齊墩果酸和熊果酸對照品溶液，按2.2項(xiàng)制備方法制備，測定齊墩果酸和熊果酸的含量，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9 樣品含量測定 取不同采收期干燥至恒重的女貞子(過三號篩)樣品1.0g，按2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，在2.3項(xiàng)色譜條件下，測量峰面積并用外標(biāo)法計(jì)算樣品中齊墩果酸與熊果酸的含量，樣品含量測定結(jié)果見表2。

表2 不同采收期女貞子中齊墩果酸和熊果酸的含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 檢測波長確定 齊墩果酸和熊果酸的全波長UV圖發(fā)現(xiàn)其在紫外末端有吸收，本實(shí)驗(yàn)選取205nm為齊墩果酸和熊果酸檢測波長。

3.2 流動相的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[14-15]，對齊墩果酸和熊果酸分離用流動相配比進(jìn)行優(yōu)化，最后以乙腈∶甲醇∶水(1000mL含2mL磷酸和4mL三乙胺)=50∶33∶17，兩者分離度大于1。

3.3 檢測池的選用 本實(shí)驗(yàn)采用Agilent可變波長檢測器(VWD)和二極管陣列檢測器(DAD)，分別進(jìn)樣同濃度、同體積的齊墩果酸和熊果酸混合對照品溶液，測定其峰面積，比較測定結(jié)果。結(jié)果顯示采用VWD檢測器測得的峰高和峰面積較DAD檢測器均低，其原因在于：VWD檢測器的檢測池體積有10μL，而DAD檢測器的檢測池的體積只有1μL，本實(shí)驗(yàn)采用后者檢測器。

3.4 女貞子采收時期的確定 表2中不同采收期女貞子中齊墩果酸和熊果酸的含量測定結(jié)果，表明江西南昌市灣里區(qū)在上述采收期內(nèi)的女貞子中齊墩果酸和熊果酸的含量變化不大，并非在冬至前后會較高，故推斷兩成分與“女貞子在冬至前后采收”無關(guān)。

為此本文采用HPLC-FP[16]方法對上述不同采收期的女貞子中的紅景天苷和特女貞苷含量進(jìn)行了測定，以進(jìn)一步判斷上述兩成分是否會受到女貞子采收時期影響。結(jié)果見圖2。

圖2 不同采收期女貞子中特女貞苷和紅景天苷含量變化趨勢圖

上述結(jié)果表明：女貞子中特女貞苷和紅景天苷的含量與“女貞子在冬至后采收”無關(guān)。女貞子在中醫(yī)臨床用于滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)，屬于補(bǔ)益類藥物，其最佳采收期是否與其多糖等成分相關(guān)，仍有待下一步考察。