★ 徐彭 謝慧慧 談偉鋒 劉波*

(江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南昌 330004)

毛竹屬于喬本科剛竹屬,四季常青,主要分布在我國長江以南,集中在長寧,江安等地,在江西也有大量分布,是我國主要竹類品種之一。毛竹筍則是在毛竹地上部分根莖上生長的嫩芽或鞭,是一種營養(yǎng)豐富的特色食材,研究發(fā)現(xiàn)毛竹筍富含多酚,生物堿,膳食纖維,氨基酸,總黃酮,多糖,植物甾醇等多種化學(xué)成分[1-4],但有關(guān)其藥用價值的報道并不多。竹筍中所含的總黃酮和甾醇均具有抗氧化、抗菌等藥理作用[6],且多糖和黃酮類化合物是防治急性肝損傷的主要成分[7-10]。本文主要采用南昌灣里梅嶺生長的毛竹筍,通過腹腔注射D-氨基半乳糖復(fù)制小鼠急性肝損傷模型,探討毛竹筍醇提物對急性肝損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級昆明種小鼠,18～22g,雌雄各半,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2011-0003。小鼠進入實驗室飼養(yǎng)1周后用于研究,實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標準,環(huán)境恒濕,室溫20℃～23℃,實驗期間自由飲水,實驗前12 h禁食。

1.1.2 藥材與試劑 毛竹筍是生長在江西省南昌市灣里區(qū)梅嶺區(qū)域,清明時節(jié)采收,經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉勇教授鑒定為毛竹Phyllostachys edulis(Carr.)Lehaie 鮮筍。由江西省兒童醫(yī)院藥劑科采用乙醇提取,濃縮制備；D-氨基半乳糖購于sigma公司(批號：137238)；聯(lián)苯雙酯滴丸購于浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠(批號：120523)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)試劑盒購于南京建成生物工程研究所(批號:20140705,20140709)。

1.1.3 實驗儀器 倒置相差顯微鏡(德國Leica公司)；自動轉(zhuǎn)輪切片機(德國Leica公司)；UV-2102C型紫外可見分光光度計(尤尼科上海儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組、模型復(fù)制及給藥 60只小鼠隨機分成6組,即正常組、模型組、聯(lián)苯雙酯陽性組、毛竹筍醇提物高、中、低劑量組,每組10只。模型組和正常組灌胃給予生理鹽水,聯(lián)苯雙酯陽性組灌胃給予150mg/kg, 毛竹筍醇提物給藥組依據(jù)高、中、低劑量分別灌胃給予生藥量為28.13,14.06,7.03g/kg的毛竹筍醇提物,連續(xù)給藥7天,在末次給藥后,除正常組小鼠注射生理鹽水外,其余各組小鼠均按500mg/kg劑量腹腔注射10%D-氨基半乳糖以復(fù)制急性肝損傷模型。造模后禁食不禁水,12h后眼眶取血,室溫靜置2h后,4℃,4000 r/min轉(zhuǎn)速離心10min,收集血清,置于-20℃冰箱保存待檢。

1.2.2 肝損傷指標酶含量測定 取血清,均按照試劑盒說明書進行測定血清AST、ALT的活性。

1.2.3 肝組織病理學(xué)檢查 眼眶采血后,立即剪開小鼠腹腔,取相同部位肝組織,置10%甲醛溶液固定,并經(jīng)過梯度乙醇脫水透明后進行石蠟包埋,常規(guī)切片,經(jīng)蘇木素-伊紅染色,光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟病理學(xué)形態(tài)變化。

2 結(jié)果

2.1 毛竹筍醇提物降低D-氨基半乳糖致肝損傷小鼠血清AST、ALT的活性 與正常組相比,模型組小鼠血清中的ALT、AST均顯著升高(P<0.01),說明肝細胞損害,急性肝損傷的模型復(fù)制成功。與模型組相比,陽性藥物組和毛竹筍醇提物高、中、低劑量組各小鼠血清ALT均有顯著降低(P<0.01)；陽性藥物組和毛竹筍醇提物高、中、低劑量組小鼠血清中的AST也有降低,且呈劑量依賴性(見表1),說明毛竹筍醇提物具有保護肝細胞的作用,降低D-氨基半乳糖對肝臟的損害。

表1 毛竹筍醇提物對D-氨基半乳糖致肝損傷小鼠血清AST、ALT活性的影響(n=10)

注：與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01；與正常組相比,##P<0.01。

2.2 毛竹筍醇提物改善D-氨基半乳糖致肝損傷小鼠的肝組織病理變化 由圖1顯示,正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常, 肝細胞結(jié)構(gòu)完整,細胞分界清晰,肝索呈放射狀有序排列。模型組小鼠肝組織正常結(jié)構(gòu)消失,細胞索排列紊亂,肝細胞廣泛脂肪變性,中央靜脈周圍的細胞大多出現(xiàn)空泡樣變性。與模型組相比,陽性藥組小鼠大部分肝臟肝細胞結(jié)構(gòu)清晰,但小部分細胞還存在輕度肝細胞脂肪變性。相比模型組而言,不同濃度的毛竹筍醇提物均能使肝細胞的損傷減輕,毛竹筍醇提物高、低劑量組雖仍能看到少量肝細胞的脂肪性病變,但空泡樣變性明顯減少。

A：正常組；B：模型組；C：聯(lián)苯雙酯陽性組(150mg/kg)；D: 毛竹筍醇提物高劑量組 (28.13g/kg)；E：毛竹筍醇提物中劑量組(14.06g/kg)；F：毛竹筍醇提物低劑量組(7.03g/kg)。

圖1 1小鼠肝臟的病理切片(HE×100)

4 結(jié)論

急性肝損傷主要由某些物質(zhì)刺激引起,如飲酒過度,誤食有毒物質(zhì),病毒感染等,導(dǎo)致肝細胞發(fā)生不同程度的腫脹、變性、壞死和凋亡的病理變化[11]。D-氨基半乳糖可引起與人類急性肝損傷相似的肝細胞形態(tài)和功能損傷,D-氨基半乳糖與細胞內(nèi)磷酸尿苷結(jié)合形成復(fù)合物,干擾肝細胞內(nèi)磷酸尿嘧啶核苷的形成,引起肝細胞損傷[12]。AST、ALT主要存在于肝細胞中,當(dāng)肝臟受到刺激或是損傷時,肝細胞AST、ALT大量釋放入血,使血清AST、ALT活性升高,因此,AST、ALT活性通常作為肝功能受損的重要監(jiān)測指標,反映肝細胞有無損傷及損傷的嚴重程度[13-14]。

本研究結(jié)果顯示,小鼠經(jīng)腹腔注射D-氨基半乳糖后,血清AST、ALT活性均顯著升高,且肝組織病理切片顯示肝組織細胞不同程度的損害。毛竹筍作為常見的餐桌食品,味道鮮美,且具有一定的藥用價值,前期研究發(fā)現(xiàn)對酒精致肝臟損害有一定的保護作用, 認為毛竹筍能增強急性肝損傷小鼠血清SOD活性和減少MDA含量,提高肝組織抗氧化能力[15]。而本研究發(fā)現(xiàn)毛竹筍醇提物也能顯著降低D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的急性肝損傷模型小鼠血清AST、ALT活性,進一步說明毛竹筍對肝細胞有保護作用。同時組織病理也顯示,毛竹筍醇提物能明顯減輕肝細胞腫脹、變性、壞死和凋亡等病理變化。但毛竹筍醇提物對肝組織的保護作用是否與抗氧化有關(guān),還有待進一步探討。