王 蕓 吳福建 蘭 峰 任學(xué)軍

生物起搏是當(dāng)前治療緩慢型心律失常的研究熱點，能克服傳統(tǒng)起搏器置入可能出現(xiàn)的感染、電池耗竭、導(dǎo)線磨損等問題[1]。胚胎期的轉(zhuǎn)錄因子能夠從竇房結(jié)發(fā)育的上游信號通路調(diào)控細(xì)胞的發(fā)育，動物模型研究表明轉(zhuǎn)錄因子Tbx18對早期竇房結(jié)功能特異性至關(guān)重要[2]，利用基因技術(shù)在離體和動物在體環(huán)境中過表達(dá)Tbx18，可以使心室肌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槠鸩珮蛹?xì)胞[3]。但是 Tbx18 是否能使人源性誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes， hiPSC)向自律性較高的起搏樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化仍然未知。我們的實驗旨在探索Tbx18轉(zhuǎn)染是否能使hiPSC分化的心肌細(xì)胞向竇房結(jié)樣起搏細(xì)胞分化，從而為其在心臟生物起搏的治療方面做好準(zhǔn)備。

材料與方法

1.實驗材料 CardioEasy?人心肌細(xì)胞(Cellapy:CA2101106)、人心肌細(xì)胞鋪底工作液(Cellapy:Cat. CA2010100/ CA2010500)、心肌接種培養(yǎng)基(Cellapy:CA2002009)、人心肌細(xì)胞純化培養(yǎng)基(Cellapy:CA2005100)、心肌維持培養(yǎng)基(Cellapy:CA2003100)、人心肌細(xì)胞消化液(Cellapy:CA2006009)、細(xì)胞培養(yǎng)級DMSO(Sigma： Cat. D2650)，細(xì)胞培養(yǎng)級的PBS溶液(Hyclone： Cat. SH30256.01)、 腺病毒載體Ad.Tbx18、Ad.GFP(吉凱公司),人HCN4單克隆抗體美國 (Abcam公司)，Trizol試劑、實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)儀，倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(日本olympus 公司)，電泳儀、 電泳槽。

2． hiPSC心肌細(xì)胞純化、接種及鑒定 (1)材料準(zhǔn)備：①在60mm培養(yǎng)皿中添加人心肌細(xì)胞鋪底工作液至完全覆蓋皿底，37℃包被4h以上備用。②室溫下平衡心肌細(xì)胞接種培養(yǎng)基，吸去培養(yǎng)皿中的鋪底工作液，加入適量接種培養(yǎng)基，置于 5% CO2， 37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中。(2)心肌細(xì)胞消化：③取 CardioEasy?人心肌細(xì)胞1瓶，PBS 溶液清洗一次，加入心肌細(xì)胞消化液使之完全覆蓋瓶底，37℃恒溫， CO2培養(yǎng)箱孵育15～30 min，顯微鏡下觀察到大部分細(xì)胞間連接消失，細(xì)胞呈現(xiàn)單個圓形。④用移液槍吹打制成單細(xì)胞懸液，并轉(zhuǎn)至 15mL 離心管中，再用適量 PBS 溶液清洗培養(yǎng)瓶，收集剩余細(xì)胞加入同一離心管中，200g 離心 5 min。⑤棄去上清，用接種培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并按 2∶1～3∶1 的比例接種到準(zhǔn)備好的皿，水平十字搖勻。(3)心肌細(xì)胞純化：5% CO2， 37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h，更換為心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基，待心肌細(xì)胞穩(wěn)定搏動 2 d后，用PBS 溶液清洗1次，更換為心肌細(xì)胞純化完全培養(yǎng)基。5% CO2， 37℃恒溫箱中培養(yǎng)4d，加入 PBS 溶液清洗1次去除死細(xì)胞，更換為心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)，1～3 d后，可觀察到細(xì)胞恢復(fù)搏動，細(xì)胞純度變高。(4)心肌細(xì)胞鑒定：RT-PCR檢測NKX2-5，MYH6, MYH7, MLC2V等心肌細(xì)胞特異性基因在hiPSC-CM中的表達(dá)情況。

3．病毒轉(zhuǎn)染 取純化的hiPS-CM細(xì)胞接種入12 孔板中，當(dāng)細(xì)胞80%融合時分別以不同的感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection, MOI)值(10、20、30、50、70、100)分別加入Ad.GFP.Tbx18和Ad.GFP進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用心肌維持培養(yǎng)基定容為 500μL，2 h 后補(bǔ)加至 1 mL。培養(yǎng) 48h 后換液，72 h 后置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化、成活率及GFP熒光比例，選擇轉(zhuǎn)染率高且細(xì)胞病死率低的MOI值使用上述方法進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)染。

4． 轉(zhuǎn)染后觀察細(xì)胞形態(tài)和搏動頻率變化 將純化的hiPS-CM細(xì)胞接種入12孔板中，待生長至70%融合時，使用最佳病毒濃度轉(zhuǎn)染hiPS-CM細(xì)胞，實驗組、GFP組分別轉(zhuǎn)染4孔，空白對照組4孔。48 h 后換液，72 h 后開始顯微鏡下觀察。在倒置顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染Tbx-18的細(xì)胞形態(tài)和搏動頻率，第1、3、5、7、14、21天分別計數(shù)三組心率變化、觀察細(xì)胞形態(tài)變化。每組從各孔隨機(jī)取3個視野，分別計數(shù)視野中細(xì)胞簇的搏動頻率，取平均值，各視野分別錄像1分鐘。

5．實時定量 PCR 檢測起搏細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá) 轉(zhuǎn)染10d后采用 Trizol 試劑提取各組細(xì)胞的總 RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，行qRT-PCR。PCR反應(yīng)體系為： 2×SYBR Green 染料 12.5μL，引物混合物 1μL，cDNA2μL，ddH2O 2μL，PCR 反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 1 min，55℃ 2 min，35個循環(huán)，延伸 5 min。延伸時讀板，收集熒光值。以GAPDH作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算產(chǎn)物相對量。

6．統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1．人誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞形態(tài)表型及功能鑒定 通過 MLC2v、MLC2a 和 HCN4 等心肌工作細(xì)胞及起搏細(xì)胞特異性蛋白的免疫熒光檢測，表明hiPS-CMs為細(xì)胞混合體，含有約 70%～80%的心室肌細(xì)胞、20%～30%的心房肌細(xì)胞和<5%的竇房結(jié)樣細(xì)胞。這些細(xì)胞表達(dá)常規(guī)的心肌特異性基因，包括多種收縮蛋白和離子通道，同時具備經(jīng)典的心肌細(xì)胞電生理活性，能夠?qū)﹄娚砗蜕锘瘜W(xué)刺激做出心肌細(xì)胞的常規(guī)反應(yīng)。

圖1 左圖：hiPSC及hiPSC-CMs鏡下圖像(10x)。A:重編程后純化的hiPSC；B:誘導(dǎo)分化后未純化的心肌細(xì)胞；C:純化3天后的心肌細(xì)胞；D:純化7天后的心肌細(xì)胞；右圖： RT-PCR檢測CardioEasy?人心肌細(xì)胞能夠表達(dá)常規(guī)的心肌特異性基因

圖2 病毒轉(zhuǎn)染效率圖 (×10)

2.病毒轉(zhuǎn)染效率 病毒轉(zhuǎn)染后 48 h 于顯微鏡下觀察(10X)，MOI=10組細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變，細(xì)胞大部分貼壁生長，死亡細(xì)胞較少；MOI=30組漂浮死亡細(xì)胞數(shù)量較前組多，部分細(xì)胞形態(tài)變?yōu)閳A形,細(xì)胞間連接減少；MOI=50組死亡細(xì)胞數(shù)量前組相似，大多數(shù)細(xì)胞形態(tài)變?yōu)樗笮?；MOI=100組細(xì)胞數(shù)量減少，死亡細(xì)胞較多。72 h 后置于熒光顯微鏡下觀察(×10)，三組均有綠色熒光表達(dá)，MOI=10與MOI=30 組組熒光亮度較弱，熒光細(xì)胞幾乎沒有；MOI=50 組熒光亮度較強(qiáng)，熒光細(xì)胞數(shù)目與之相似，MOI=100組熒光亮度較強(qiáng)，與前組相似，但漂浮死亡細(xì)胞較多。綜合考慮轉(zhuǎn)染率與細(xì)胞病死率，我們選用 MOI=50 作為最佳轉(zhuǎn)染劑量。

3． 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞形態(tài)功能變化 加病毒1d心肌細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，以多邊形為主，可見少量梭形、菱形細(xì)胞，細(xì)胞間形成聯(lián)系，可見均一的同步化跳動的單層心肌組織，頻率多在35bpm左右；3～7d細(xì)胞形態(tài)逐漸改變，以梭形、紡錘形為主，細(xì)胞間聯(lián)系減少，搏動頻率逐漸增加，在60次/min左右。7～ 21d后細(xì)胞形態(tài)較前無明顯變化，部分形成新的細(xì)胞間連接，可見細(xì)胞簇，搏動頻率較前無明顯增加，18d后細(xì)胞搏動逐漸減弱(圖3)。

TBX18組的搏動頻率明顯快于GFP組[(61.33±13.5)vs.(33.01±1.67)次/min，P<0.01](表1，圖4)，說明Tbx18 可以顯著提高h(yuǎn)iPSC-CMs的搏動頻率；GFP與空白對照組之間搏動頻率并無差異(P>0.05)，說明腺病毒轉(zhuǎn)染基本不影響hiPSC-CMs的活性及功能。

圖3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞形態(tài)功能變化

組別平均心率標(biāo)準(zhǔn)差最小心率最大心率tbx-18(n=21)61.3313.53574GFP(n=21)33.011.673036空白(n=21)35.051.283337

圖4 轉(zhuǎn)染后3周各組心率變化

4．轉(zhuǎn)染后起搏細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)改變情況 用腺病毒載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞4d，進(jìn)行起搏相關(guān)基因HCN4表達(dá)量的檢測，得出5×106(MOI=50)為最佳病毒轉(zhuǎn)染濃度，并以HCN4表達(dá)量為參照。實驗組(Ad.Tbx18)與對照組(Ad.GFP)同時轉(zhuǎn)染腺病毒載體4d后qRT-PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)變化情況，發(fā)現(xiàn)起搏功能相關(guān)基因HCN4 mRNA 表達(dá)水平明顯高于GFP組(P<0.05)；Tbx18組較GFP組KIR2.1、SCN5A、CX43等心室肌特異性基因表達(dá)明顯減低。分析顯示hiPSC-CM在后續(xù)培養(yǎng)過程中持續(xù)表達(dá)竇房結(jié)細(xì)胞的特異性結(jié)構(gòu)基因 HCN4，其表達(dá)量隨時間延續(xù)而增加。

圖5 轉(zhuǎn)染后起搏細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)改變情況

討 論

位于竇房結(jié)中心區(qū)的結(jié)細(xì)胞是典型的起搏細(xì)胞,細(xì)胞較小，呈梭形或長梭形，細(xì)胞中僅有散在的肌絲，幾乎沒有線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。結(jié)細(xì)胞的自律性基礎(chǔ)來源于產(chǎn)生4期自動去極化的If電流，而HCN4通道是產(chǎn)生If電流的特異性離子通道[4-5]。已有研究利用基因技術(shù)使棕色脂肪源性干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞過表達(dá)HCN通道，從而獲得具有一定自律性的起搏樣細(xì)胞[6]。這些方法的不足之處在于，基因轉(zhuǎn)染單個或多個離子通道雖有一定起搏功能，但其細(xì)胞表型與竇房結(jié)相差甚遠(yuǎn)，且對自主神經(jīng)調(diào)控反應(yīng)差，干細(xì)胞移植其潛在的致瘤風(fēng)險較大等。因此進(jìn)一步的研究方向轉(zhuǎn)移到竇房結(jié)發(fā)育過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子家族上來，嘗試從竇房結(jié)胚胎發(fā)育的上游調(diào)控的角度構(gòu)建生物起搏器[7]，其中轉(zhuǎn)錄因子Tbx18的研究結(jié)果最令人矚目[8]。

Tbx18 屬于轉(zhuǎn)錄因子 T-box 家族，位于染色體6q14-q15，是胚胎發(fā)育期重要的轉(zhuǎn)錄因子，目前已有較多在體及離體實驗研究表明Tbx18 能影響竇房結(jié)的發(fā)育，且Tbx18的轉(zhuǎn)錄激活因子能誘發(fā)心外膜和平滑肌的分化作用[9-10]。Kapoor等[2]以病毒為載體將一組轉(zhuǎn)錄因子(Shox2、TBX3、TBX5、TBX18、TBX20)分別轉(zhuǎn)入新生心室肌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有Tbx18增加心肌細(xì)胞自律性，并且HCN4表達(dá)增加，動作電位和細(xì)胞形態(tài)顯示出竇房結(jié)樣改變。因此，本研究中我們選擇導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子TBX18，以使工具細(xì)胞獲得起搏功能。

以細(xì)胞為基礎(chǔ)構(gòu)建的生物起搏器的研究已經(jīng)能產(chǎn)生起搏功能。細(xì)胞生物起搏指將具有起搏功能或可分化為具有起搏功能的細(xì)胞移植到受損的傳導(dǎo)組織中，進(jìn)行細(xì)胞修復(fù)或替代[11]。常用的種子細(xì)胞如胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、成體細(xì)胞等，但胚胎干細(xì)胞的免疫原性、致畸性及倫理問題限制了其發(fā)展，間充質(zhì)干細(xì)胞移植的轉(zhuǎn)化及調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確，且其長期療效及安全性尚需進(jìn)一步評估。近年來體細(xì)胞重編程[12-14](reprogram)及iPSC定向分化技術(shù)的[15]迅速發(fā)展，為種子細(xì)胞提供了良好的選擇。目前iPS細(xì)胞在心血管疾病研究和治療中的應(yīng)用主要在藥物篩選及遺傳性心臟疾病的模型建立，用于移植治療的研究還處于基礎(chǔ)實驗階段，細(xì)胞移植的安全性及其功能表達(dá)的持久性需要進(jìn)一步隨訪評價。

我們使用Tbx18 的腺病毒載體對 hiPSC-CMs進(jìn)行了轉(zhuǎn)染,熒光顯微鏡顯示轉(zhuǎn)染成功，由于之前并沒有關(guān)于 Ad-Tbx18 轉(zhuǎn)染人源性誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞的報道，我們首先對轉(zhuǎn)染的安全性和有效性進(jìn)行評估。結(jié)合倒置顯微鏡的觀察結(jié)果，我們認(rèn)為 MOI=50 為最適宜的轉(zhuǎn)染滴度，并在后續(xù)實驗中利用此滴度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過21天顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞體積變小、細(xì)胞間連接減少、細(xì)胞形態(tài)似長梭形，類似于竇房結(jié)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞搏動頻率明顯增加且不依賴Tbx18的持續(xù)表達(dá)，在轉(zhuǎn)染 72h 后，Tbx18 轉(zhuǎn)染細(xì)胞較對照組出現(xiàn)了HCN4 表達(dá)明顯增高，說明轉(zhuǎn)染了 Tbx18 的hiPS-CMs出現(xiàn)了向起搏結(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢，預(yù)計hiPS心肌細(xì)胞可作為較穩(wěn)定的種子細(xì)胞。

本實驗中存在一些問題：如人竇房結(jié)細(xì)胞缺少特異性表達(dá)的基因或蛋白標(biāo)志，僅能使用心率變化或具有起搏功能的離子通道基因變化來提示細(xì)胞轉(zhuǎn)化，無法確定轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞即為竇房結(jié)細(xì)胞；未進(jìn)行膜片鉗等實驗驗證單個細(xì)胞是否具有起搏細(xì)胞特異性動作電位；轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞能否長久生存等，這些問題有望在后續(xù)進(jìn)一步的實驗中得到解決。

綜上所述，本實驗中我們采用人誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞為工具，導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子Tbx18后，hiPS-CMs的形態(tài)和功能發(fā)生改變，從起初具有緊密細(xì)胞間聯(lián)系的多邊形變?yōu)殚L梭形細(xì)胞，細(xì)胞搏動頻率顯著增加，起搏相關(guān)基因表達(dá)明顯增加，心室肌特異性基因表達(dá)下調(diào)，使原本純度70%以上的心室肌細(xì)胞大部分向竇房結(jié)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化,成功構(gòu)建了類竇房結(jié)樣起搏細(xì)胞。本實驗探索了人源性誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞向起搏細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法，進(jìn)一步目標(biāo)希望能探索出誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向不同種類心肌細(xì)胞定向分化的方法。