劉夢如 王 悅 王 越 楊 敏 卜 軍 吳小凡

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, As)是冠心病和腦卒中發(fā)生的首要原因。As具有典型的炎癥變性、滲出及增生特點，在斑塊破裂處常有巨噬細胞的浸潤、平滑肌細胞增生及多種炎性因子的表達升高。因此減輕病變炎癥反應(yīng)，延緩As進展成為了近年研究熱點。既往研究證實，β3腎上腺素能受體(β3 adrenergic receptors, β3AR)是心血管功能的重要調(diào)節(jié)因子，其主要在心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞與脂肪細胞中表達[1]。β3AR激活后可通過促進血管舒張、改善脂質(zhì)代謝、防御氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)損傷等多重機制起到重要的心血管保護作用[2]。米拉貝隆是高選擇性的β3AR激動劑，因其舒張膀胱逼尿肌的功能已被批準(zhǔn)用于膀胱過度活動癥的治療[3]。新近隨機對照研究發(fā)現(xiàn)，米拉貝隆可改善心力衰竭患者的左心室射血分數(shù)，其主要機制為有效抑制了心肌組織氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)[4]。然而，米拉貝隆是否具有延緩As的作用尚不明確。本研究通過構(gòu)建載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠As模型，觀察米拉貝隆干預(yù)對As斑塊進展的影響。

材料與方法

1.材料與試劑 無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級ApoE-/-小鼠及高脂飼料(含21%脂肪，0.15%膽固醇)購自北京華阜康生物科技股份有限公司；米拉貝隆購自Med Chem Express公司；油紅O 染色液購于美國Sigma公司；HE染液購于碧云天公司；Masson三色染液試劑盒購于Leagene公司；CD68、α-SMA抗體購于美國Abcam公司。

2.實驗方法 (1)動物分組及模型建立：SPF級,8周齡,雄性,ApoE-/-小鼠16只，在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院動物實驗中心適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。給予ApoE-/-小鼠高脂飲食16周，建立As模型。隨機分為米拉貝隆組(8只，每天10mg/kg，灌胃)和安慰劑組(8只，每天等量1%DMSO的0.9%氯化鈉液，灌胃)；另設(shè)C57BL/6J 8周齡雄性小鼠空白對照組(8只，每天等量1%DMSO的0.9%氯化鈉液，灌胃)，6周后處死取材。

(2)標(biāo)本采集與處理 取材前夜禁食水，次日處死后剖開胸腔，體視顯微鏡下剝離主動脈。分離小鼠心臟，將心臟基底部以4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋。于主動脈3個瓣葉水平，將組織塊切為5um厚的連續(xù)石蠟切片。

(3) ApoE-/-小鼠主動脈斑塊表面積及橫截面積測定 各組ApoE-/-小鼠主動脈根部石蠟切片進行油紅O染色及HE染色。照相后用NIS-ELEMENT軟件測定As斑塊表面積與動脈壁表面積，計算As斑塊表面積與動脈壁表面積的百分比。

(4) ApoE-/-小鼠As斑塊成分測定 各組ApoE-/-小鼠主動脈根部石蠟切片進行Masson三色染色、抗CD68和抗α-SMA免疫組織化學(xué)染色。顯微鏡下照相，利用NIS-ELEMENT軟件，計算Masson染色下膠原纖維面積與動脈管壁面積百分比；計算抗CD68和抗α-SMA染色下，陽性染色面積與動脈管壁面積百分比，分別反映As斑塊中巨噬細胞及平滑肌細胞的數(shù)目。

3.統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism7.0圖像軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA), 符合正態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)間比較用SNK法檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1．米拉貝隆對ApoE-/-小鼠主As斑塊面積的影響 安慰劑組小鼠較空白對照組相比主動脈斑塊表面積(P<0.05)及橫截面積(P<0.05)顯著增大。與安慰劑組比較，米拉貝隆組小鼠主動脈斑塊表面積(P<0.05)及橫截面積(P<0.05)顯著減少(表1，圖1)。

表1 米拉貝隆對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊面積的影響

注:與對照組比較，aP<0.05；與安慰劑組比較，bP<0.05

圖1 各組小鼠斑塊面積變化A：油紅O染色示各組小鼠主動脈斑塊表面積(n=3)；B：各組小鼠斑塊表面積占動脈壁表面積的百分比；C：蘇木精伊紅染色示各組小鼠斑塊橫截面積(40x，n=8)；D：各組小鼠斑塊橫截面積占血管管腔的百分比。1：空白對照組；2： 安慰劑組；3：米拉貝隆組。注:兩兩比較,*P<0.05

圖2 各組小鼠斑塊成分變化A：CD68免疫組織化學(xué)染色示各組小鼠主動脈斑塊巨噬細胞浸潤(400x，n=8)；B：各組小鼠斑塊CD68陽性面積占動脈壁總面積的百分比；C：α-SMA免疫組化染色示各組小鼠主動脈斑塊平滑肌增殖(400x，n=8)；D：各組小鼠斑塊α-SMA陽性面積占動脈壁總面積的百分比。E：Masson染色示各組小鼠主動脈斑塊膠原纖維(200x，n=8)；F：各組小鼠斑塊膠原纖維面積占動脈壁總面積的百分比。1：對照組；2：安 慰劑組；3：米拉貝隆組。注：兩兩比較，*P<0.05

2. 米拉貝隆對ApoE-/-小鼠主As斑塊成分的影響 與空白對照組比較，安慰劑組小鼠主動脈斑塊中膠原纖維面積(P<0.05)，巨噬細胞(P<0.05)及平滑肌細胞(P<0.05)數(shù)目均顯著增多。與安慰劑組比較，米拉貝隆組小鼠主動脈斑塊中膠原纖維面積(P<0.05)，巨噬細胞(P<0.05)、平滑肌細胞(P<0.05)數(shù)目顯著減少。與空白對照組比較，米拉貝隆組小鼠主動脈斑塊中膠原纖維面積及平滑肌細胞數(shù)目增多，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表2，圖2)。

討 論

我們的研究發(fā)現(xiàn)，米拉貝隆可減小ApoE-/-小鼠主動脈硬化斑塊表面積及橫截面積，減少As斑塊中巨噬細胞、平滑肌細胞數(shù)目及膠原纖維，提示米拉貝隆具有延緩As進展的作用。

表2 米拉貝隆對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊成分的影響

注：與對照組比較，aP<0.05；與安慰劑組比較，bP<0.05

β腎上腺素能受體廣泛表達于心臟及血管組織中[1]，β1與β2AR激活可調(diào)節(jié)心肌收縮及血管平滑肌松弛，而β3AR激活則具有調(diào)節(jié)糖脂代謝，抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的作用。既往有研究表明在給予ApoE-/-小鼠β3AR激動劑BRL37344干預(yù)后，其主動脈硬化斑塊面積明顯縮小[5]；Berbée等[6]還發(fā)現(xiàn), 激活β3AR可加快ApoE-/-小鼠和Ldlr-/-小鼠的脂質(zhì)降解，顯著減少血清LDL-C的表達。以上研究均提示β3AR激活后具有抗As作用。

米拉貝隆是一種高選擇性、高效能的β3AR激動劑，因其激動β3AR后促進膀胱逼尿肌松弛并增加肌肉穩(wěn)定性而作為治療膀胱過度活動癥的臨床用藥，在相關(guān)的臨床研究中已經(jīng)證實米拉貝隆具有良好的安全性和耐受性[3]。近年來，隨著β3AR在心血管疾病病理進程中的重要作用逐漸被發(fā)現(xiàn)[7]，米拉貝隆對心血管疾病的治療作用逐漸成為研究熱點Bundgaard等[4]通過隨機對照研究揭示, 米拉貝隆能提高慢性心力衰竭患者的左心室射血分數(shù)，但目前米拉貝隆對As的作用尚不明確，因此，本研究以米拉貝隆干預(yù)ApoE-/-小鼠，觀察As的進展情況，結(jié)果顯示，與安慰劑組比較，米拉貝隆組小鼠主動脈硬化斑塊表面積與橫截面積均顯著減小，提示米拉貝隆可延緩ApoE-/-小鼠As病程的發(fā)展。

As是一種慢性炎癥性疾病，血管內(nèi)皮損傷后，單核細胞遷移進入動脈內(nèi)膜分化為巨噬細胞以及平滑肌細胞過度增生是As的重要病理生理過程[8]。斑塊周圍浸潤的巨噬細胞可分泌炎癥因子，促進炎癥反應(yīng)，加重斑塊的不穩(wěn)定性[9-10]；炎癥反應(yīng)加重可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞壞死，引起細胞外基質(zhì)增多沉積，導(dǎo)致動脈血管纖維化加重，加速As的病程發(fā)展[11]，因此，抑制炎癥反應(yīng)，減少巨噬細胞、平滑肌細胞浸潤及纖維化，可作為延緩As發(fā)展的有效治療手段。我們的研究表明，與安慰劑組相比，米拉貝隆組小鼠As斑塊中巨噬細胞、平滑肌細胞和膠原纖維等成分的表達均明顯降低。更值得注意的是，與空白對照組相比，米拉貝隆組小鼠管壁平滑肌細胞和膠原纖維的數(shù)量有所增加，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示米拉貝隆在減弱斑塊周圍炎癥反應(yīng)、減少平滑肌細胞浸潤和血管纖維化中可能發(fā)揮重要作用，這可能是其延緩As發(fā)展的重要原因。

綜上所述，本研究的結(jié)果提示米拉貝隆可能通過減少As斑塊中的巨噬細胞、平滑肌細胞浸潤及膠原纖維成分而減緩As的進展。提示了米拉貝隆在As的防治方面具有良好的臨床應(yīng)用前景。米拉貝隆是否也通過血脂代謝和氧化應(yīng)激等途徑影響As仍需要在未來的研究中進一步探索，其作為抗As藥物走上臨床應(yīng)用也仍存在很多問題值得進一步研究。