陳博雅 張聰聰 李玉琳 王綠婭 杜 杰

心臟成纖維細(xì)胞過度分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程中非常重要[1]。成纖維細(xì)胞和心臟損傷后的炎癥啟動(dòng)關(guān)系密切[2]。但目前對(duì)心臟成纖維細(xì)胞的了解甚少; 轉(zhuǎn)錄因子ATF3(activating transcription factor 3)參與調(diào)控心臟后負(fù)荷增大引起的心肌細(xì)胞肥大和心臟肥厚[3]，參與調(diào)控脂質(zhì)沉積導(dǎo)致的血管細(xì)胞凋亡和炎癥浸潤[4]。ATF3在穩(wěn)態(tài)下低表達(dá)，但多種刺激可誘導(dǎo)ATF3表達(dá)快速升高。ATF3既可促進(jìn)又可抑制基因轉(zhuǎn)錄取決于其細(xì)胞來源及所受刺激[5]。ATF3全敲除不便于揭示ATF3在心血管疾病中功能，為此，本研究擬運(yùn)用Cre /loxP重組酶系統(tǒng)構(gòu)建成纖維細(xì)胞特異性敲除ATF3小鼠，為進(jìn)一步研究ATF3在心血管疾病中作用及機(jī)制提供條件。

材料與方法

1.儀器和試劑 冰凍切片機(jī)(德國Leica公司)，激光共聚焦顯微鏡(TCS 4D; Leica)，NIS-Elements 定量分析軟件，DNA凝膠電泳。他莫昔芬(美國Sigma公司)，鼠尾消化液DirectPCR(美國VIAGEN公司)， ATF3抗體(美國sigma公司)，Vimentin抗體(英國abcam公司)，CD-45抗體、CD31抗體、PDGFRα抗體(BD生物)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國promega公司), SYBR 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)混合物(日本TaKaRa公司)。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成纖維細(xì)胞標(biāo)志基因Col1a2攜帶雌激素受體驅(qū)動(dòng)的Cre小鼠(Col1a2-ERCre)小鼠購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室; ATF3fl/fl小鼠由本課題組構(gòu)建，均為 C57BL/6J 品系。實(shí)驗(yàn)小鼠均在SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，清潔飲食，溫濕度適宜。12只敲除小鼠和12只同窩野生型小鼠各分為心臟I/R組和假手術(shù)組，分選心臟成纖維細(xì)胞檢測ATF3基因表達(dá)。4只敲除小鼠和4只同窩野生型小鼠復(fù)制I/R模型，免疫熒光定位觀察心臟ATF3蛋白表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)得到北京安貞醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

3.條件性敲除小鼠構(gòu)建 利用胚胎顯微注射法在小鼠ATF3基因第3號(hào)和第4號(hào)外顯子之間插入loxP位點(diǎn)，得到ATF3wt/fl小鼠，將其F0代成年鼠與攜帶成纖維細(xì)胞特異表達(dá)Cre酶的Col1a2-ERCre小鼠交配，得到的是F1代Col1a2-ERCre/ ATF3wt/fl小鼠，F(xiàn)1代之間交配，得到Col1a2-ERCre/ ATF3fl/fl小鼠，小鼠給予他莫昔芬腹腔注射，ATF3基因被切掉，對(duì)照組為Col1a2-ERCre/ ATF3wt/wt。如圖1。

圖1 小鼠制作過程示意圖

4. 小鼠基因型鑒定 將雜交后3周齡子代小鼠剪下鼠尾，加入蛋白酶K和鼠尾裂解液1∶100比例的混合液100ul，56℃水浴過夜，85℃40min水浴變性, 提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定小鼠基因型。PCR擴(kuò)增引物分別為：ATF3fl/fl上游5’-ACTTAAGTCGTGAGGCTGGAGATGG-3’，下游5’-A AACCAGAGGAGAGTGTTGGATGGA-3’；Col1a2-ERCre上游 5’-CCTGATCCT GGCAATTTCGGCTA-3’，下游5’-TCCAATTTACTGACCGTACACC AA-3’。

5. 他莫昔芬誘導(dǎo)基因條件性敲除 給予8周齡的小鼠腹腔注射他莫昔芬(食用油溶解)，劑量為0.8mg.g-1.d-1，共注射5d，可將雌激素受體的配體結(jié)合區(qū)與Cre重組酶融合產(chǎn)生嵌合重組酶，使其進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮作用，敲除ATF3基因。

6.小鼠心臟I/R模型建立 采用本實(shí)驗(yàn)室建立模型的方法[6-7]，異氟烷誘導(dǎo)麻醉后維持麻醉，仰臥固定四肢，以左胸心尖搏動(dòng)最明顯處為突破點(diǎn)，將心臟輕輕從開口擠出來，用 7-0 絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，將心臟立即放入胸腔內(nèi)，縫合皮膚，30min后將結(jié)扎線松開。

7.心臟成纖維細(xì)胞分選 I/R手術(shù)后2h，1%戊巴比妥麻醉小鼠，0.9%氯化鈉注射液灌洗心臟后取下心臟組織，利用Ⅱ型膠原酶 37°消化獲得單細(xì)胞懸液。加入抗體anti-CD45, anti-CD31，anti-PDGFRα,室溫避光孵育 30 min，加入2mL含有3%FBS的PBS溶液終止孵育，1 500r/min，離心5min，棄掉上清液，1mL含有3%FBS的PBS重懸，濾網(wǎng)過濾，待上機(jī)。

8. ATF3基因mRNA水平檢測 心臟組織用Trizol試劑盒提取RNA, 使用Nanodrop 2000儀器測定RNA濃度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA, PCR檢測目的基因ATF3的表達(dá)量，引物設(shè)計(jì)采用Primer 5.1軟件，由北京諾賽生物科技有限公司合成，引物如下:ATF3：上游 5’-CATCCTTTGTCTCACCGGCT- 3’，下游 5’CCC ATTAGTGCGATCCTGCT-3’；GAPDH：上游5’-G CATCTTCTTGT GCAGTGCC-3’，下游 5’-GAGAAGGCAGCCCTGGTAAC-3’。

9.心臟成纖維細(xì)胞ATF3蛋白表達(dá) Col1a2-ERCre/ATF3fl/fl以及Col1a2-ERCre/ ATF3wt/wt小鼠I/R術(shù)后6h，麻醉后取心臟組織制成冰凍切片，加入ATF3及成纖維細(xì)胞標(biāo)志抗體(vimentin), 4℃,過夜，熒光二抗顯色，進(jìn)行免疫熒光共定位。激光共聚焦顯微鏡采圖。

圖4 免疫熒光檢測ATF3蛋白表達(dá)量 A:Col1a2-ERCre/ATF3wt/wt；B:Col1a2-ERCre/ATF3fl/fl注：箭頭表示ATF3在成纖維細(xì)胞定位情況, 標(biāo)尺為10μm

10.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. ATF3成纖維細(xì)胞特異性敲除小鼠基因鑒定 剪取3周齡小鼠的鼠尾，進(jìn)行小鼠基因型鑒定，如圖2A，小鼠Col1a2-ERCre基因型為陽性, 條帶為～500bp, ATF3 loxP的基因型為純合陽性, 條帶為210bp。結(jié)果表明Col1a2-ERCre/ATF3fl/fl小鼠構(gòu)建成功。

圖2 雜交小鼠子代基因型鑒定 A:Col1a2-ERCre基因的目的條帶；B:ATF3 loxP基因的目的 條帶

圖3 熒光定量PCR檢測ATF3 基因表達(dá)量 注：兩組 相比，***P<0.001

2.PCR檢測小鼠心臟成纖維細(xì)胞ATF3表達(dá)的結(jié)果 基礎(chǔ)狀態(tài)下ATF3表達(dá)量很低，與假手術(shù)組相比，術(shù)后Col1a2-ERCre/ATF3wt/wt組ATF3明顯上調(diào)[(0.02534±0.002654)vs. (0.5982±0.03495)，P<0.0001]，與術(shù)后Col1a2-ERCre/ATF3wt/wt組相比，術(shù)后Col1a2-ERCre/ATF3fl/fl組表達(dá)量仍然很低[(0.5982+0.03495)vs. (0.06456+0.005704)，P<0.0001]。結(jié)果提示ATF3成纖維細(xì)胞特異敲除成功。

3.免疫熒光觀察小鼠心臟成纖維細(xì)胞ATF3表達(dá)的結(jié)果 為了進(jìn)一步驗(yàn)證特異性敲除小鼠構(gòu)建成功，我們用免疫熒光共定位的方法檢測成纖維細(xì)胞中ATF3的表達(dá)。缺血再灌注術(shù)后，Col1a2-ERCre/ATF3wt/wt小鼠心臟成纖維細(xì)胞表達(dá)ATF3，而Col1a2-ERCre/ATF3fl/fl小鼠心臟成纖維細(xì)胞ATF3基本不表達(dá)。結(jié)果表明，ATF3成纖維細(xì)胞特異敲除成功。

討 論

缺血性心臟病是發(fā)病率高，危急生命的重大疾病，病理過程包括心肌細(xì)胞的死亡，炎癥細(xì)胞的浸潤[8]，成纖維細(xì)胞的增殖及纖維瘢痕形成，嚴(yán)重者最終導(dǎo)致心力衰竭，病理改變包括間質(zhì)纖維化，房室重塑和心室順應(yīng)性降低[9]。以往研究主要報(bào)道這一過程中心肌細(xì)胞的損傷，作為間質(zhì)中數(shù)量最多的成纖維細(xì)胞，也在疾病的病理過程中發(fā)揮重要的作用。幾乎所有心臟病都涉及以心臟成纖維細(xì)胞過度沉積細(xì)胞外基質(zhì)蛋白為特征的病理性心肌重構(gòu)，降低心室順應(yīng)性最終導(dǎo)致心力衰竭[10]。成纖維細(xì)胞是數(shù)量最多的間質(zhì)細(xì)胞，位于心肌間質(zhì)，心外膜和血管周圍區(qū)域。成纖維細(xì)胞作為心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)支架，在正常狀態(tài)下維持細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的穩(wěn)態(tài)，一旦受到病理性刺激，便由成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為其活化形式，即肌成纖維細(xì)胞，其分泌細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)纖維化[11]。已有報(bào)道，成纖維細(xì)胞參與細(xì)胞的凋亡，炎癥浸潤，心室重構(gòu)等過程[12]，對(duì)心臟損傷及修復(fù)的發(fā)生發(fā)展有重要影響。因此，研究心臟成纖維細(xì)胞在疾病過程中發(fā)揮的作用，找到新的治療靶點(diǎn)，對(duì)心血管疾病的治療有很大幫助。

轉(zhuǎn)錄因子ATF3在多種疾病的病理過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。不同的誘導(dǎo)因素及細(xì)胞種類，ATF3可參與調(diào)控不同的病理過程。在乳腺癌的發(fā)病機(jī)制中，ATF3是增強(qiáng)乳腺癌轉(zhuǎn)移的髓細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，并且可以作為乳腺癌死亡的預(yù)測因子[13]；在LPS引起的炎癥反應(yīng)中，ATF3通過抑制Toll樣受體通路而抑制炎癥反應(yīng)[14]；另外，ATF3可以調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的凋亡和遷移[15]，調(diào)控胰島細(xì)胞的分泌及凋亡[16]，參與調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化管壁中泡沫細(xì)胞的形成等[17]。ATF3在心血管疾病中發(fā)揮的作用是我們研究的重要內(nèi)容。我們課題組已經(jīng)報(bào)道過，在血管緊張素II灌注和主動(dòng)脈弓縮窄導(dǎo)致心肌肥厚的兩種小鼠模型中，心臟成纖維細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄因子ATF3的表達(dá)，提高ATF3的表達(dá)可以緩解由于后負(fù)荷增大導(dǎo)致的心肌肥厚，并減少心臟重構(gòu)[18]。

為了關(guān)注ATF3與成纖維細(xì)胞在缺血再灌注損傷中的聯(lián)系與作用機(jī)制，我們實(shí)驗(yàn)組構(gòu)建了ATF3成纖維細(xì)胞特異性敲除小鼠。Cre/loxP 重組酶系統(tǒng)在新型基因構(gòu)建中廣泛應(yīng)用，細(xì)胞水平用 Cre 重組酶識(shí)別 loxP 位點(diǎn)將目的基因切除，個(gè)體水平上將重組雜合子小鼠與 Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，篩選子代小鼠就可得到刪除目的基因的條件性敲除小鼠[19]。我們將雌激素受體的配體結(jié)合區(qū)和Cre重組酶進(jìn)行融合，雌激素使其進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮作用。避免內(nèi)源性雌激素所造成的非特異性基因敲除，將雌激素配體結(jié)合區(qū)進(jìn)行關(guān)鍵氨基酸突變，實(shí)驗(yàn)之前外源性給予雌激素類似物他莫昔芬，促使Cre酶發(fā)揮作用。ATF3在基礎(chǔ)狀態(tài)下表達(dá)量很低，興奮狀態(tài)下表達(dá)升高，為了鑒定敲除小鼠構(gòu)建成功，我們給予子代小鼠心臟缺血再灌注手術(shù)，無論是mRNA水平還是蛋白表達(dá)，野生型小鼠成纖維細(xì)胞ATF3表達(dá)升高，敲除組ATF3基本不表達(dá)，表明成纖維細(xì)胞特異性敲除ATF3的小鼠構(gòu)建成功，為接下來研究心臟成纖維細(xì)胞ATF3在心血管疾病中的作用及機(jī)制提供了重要條件。