孟雅寧，王恰恰，張業(yè)倫，蘭素缺，李光威，李杏普，古東月

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，農(nóng)業(yè)部河北作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050035；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，河北 石家莊 050051；3.館陶縣農(nóng)牧局，河北 館陶 057750）

隨著經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展和人民生活水平的日益提高，人們的生活方式與飲食習(xí)慣也正經(jīng)歷著前所未有的變革。近年來，與飲食相關(guān)的疾病如冠心病、癌癥（尤其是直腸癌和結(jié)腸癌）和糖尿病等，成為中老年人群發(fā)病和死亡的主要原因，且呈現(xiàn)出低齡化趨勢。2006年中國學(xué)生營養(yǎng)與健康促進(jìn)會(huì)發(fā)布的《中國學(xué)齡兒童少年?duì)I養(yǎng)與健康狀況調(diào)查報(bào)告》顯示，在包括血壓、體重指數(shù)、糖耐量和血脂等一系列代謝指標(biāo)的“代謝綜合征”檢測中，有64.1%的孩子至少有1項(xiàng)指標(biāo)異常。

大量醫(yī)學(xué)研究證明，抗性淀粉（RS）具有良好的營養(yǎng)特性和生理功能[1～3]。在日常飲食中增加抗性淀粉的攝入，可減緩碳水化合物的吸收速度，具有控制體重、維持餐后血糖穩(wěn)態(tài)、預(yù)防便秘和結(jié)（直）腸癌、降低血脂等生理功能。RS主要是由小部分的糊精和大部分的直鏈淀粉回生后聚合而成。直鏈淀粉是形成抗性淀粉最重要的組分。然而，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前主推小麥品種中直鏈淀粉含量僅占胚乳淀粉含量的12%～35%，而支鏈淀粉含量比例高達(dá)65%～88%[4～7]。目前，對(duì)于高直鏈淀粉品種的選育和遺傳研究嚴(yán)重不足。小麥?zhǔn)俏覈鴥H次于水稻的第二大糧食作物，也是我國北方居民的傳統(tǒng)主食作物。提高我國小麥直鏈淀粉含量，增加飲食中的抗性淀粉含量，對(duì)于全面改善公眾健康水平十分重要。

淀粉顆粒蛋白SGP-1（包含3個(gè)亞基SGP-A1、SGP-B1和SGP-D1）缺失可引發(fā)淀粉等品質(zhì)性狀發(fā)生改變，提高直鏈淀粉的相對(duì)含量。Yamamori等[8]利用SGP-A1、SGP-B1和SGP-D1 3個(gè)單缺失材料，雜交聚合獲得SGP-1三缺失材料，發(fā)現(xiàn)胚乳中短支鏈淀粉含量顯著增加，直鏈淀粉含量升高。以冀紫439等43份黑粒小麥資源為試材，開展小麥籽粒SGP-1缺失資源的鑒定及其直鏈淀粉和抗性淀粉含量的研究，可為高直鏈淀粉和高抗性淀粉小麥分子育種材料的篩選提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黑粒小麥資源共43份，包含國內(nèi)黑小麥農(nóng)家種及育成種8個(gè)，均由河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所小麥資源室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 SGP-1蛋白鑒定 SGP-1蛋白提取參照Yamamori M等[9]方法，SDS-PAGE電泳參照汪家政[10]的方法。具體步驟為：

（1）取混合均勻的全麥粉30 mg，加入0.6 mL淀粉漂洗緩沖液（55 m MTris-HCl，pH值6.8，2.3%SDS，5% β-巰基乙醇），在4℃條件下靜置過夜，13 000 r/min離心4 min；

（2）去上清液后加入1 mL淀粉漂洗緩沖液，充分?jǐn)嚢瑁?3 000 r/min離心4 min，去上清液，重復(fù)步驟（2） 3次；

（3）用1 mL雙蒸水代替淀粉漂洗液按步驟（2）漂洗2次；

（4） 加入0.6 mL提取緩沖液（淀粉漂洗緩沖液中加入10%甘油），懸浮，沸水?。?0℃） 5～10 min，后趁熱離心10～15 min，取上清液上樣電泳；

（5）分離膠濃度為10%，初始電壓130 V，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后加大電壓至300 V電泳，電泳6 h；

（6）用銀染法染膠。

1.2.2 淀粉組分含量測定

1.2.2.1 直鏈、支鏈淀粉含量測定。直鏈、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及其含量測定參照汪連愛[11]方法，直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液分別由馬鈴薯直鏈、支鏈淀粉純品（Sigma公司生產(chǎn)）制備。直鏈淀粉和支鏈淀粉的測定波長分別選定為630 nm和560 nm，參比波長分別選定為470 nm和730 nm。根據(jù)100 mg面粉測得的直鏈淀粉和支鏈淀粉質(zhì)量計(jì)算面粉中直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉的含量，以及淀粉中直鏈淀粉和支鏈淀粉的相對(duì)含量。

1.2.2.2 抗性淀粉含量測定。參照愛爾蘭Megazyme公司提供的方法測定。準(zhǔn)確稱?。?0±0.05） mg樣品，加入10 mg/mL胰α-淀粉酶＋3 IU/mL AGM混合工作溶液，于37℃水浴搖床中孵育16 h，用葡萄糖檢測試劑盒在波長510 nm分光光度計(jì)下測定吸光值，并計(jì)算抗性淀粉含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑粒小麥資源缺失SGP-1分子鑒定

利用SDS-PAGE電泳檢測方法，對(duì)43份不同來源的黑粒小麥材料進(jìn)行SGP-1蛋白鑒定。結(jié)果鑒定出缺失SGP-A1材料11份，分別為PURPLES556（MEX）、13075 （AUS）、II-66-561-3-6、6274（AUS）、6280（AUS）、湯河1號(hào)、黑小麥76、黑初8、冀紫439、黑初2和黑初27；未鑒定出SGP-B1和SGP-D1缺失材料（表1）。其中，黑初8、冀紫439、黑初2和黑初27的株高和熟期等農(nóng)藝性狀與當(dāng)前推廣種接近。

2.2 黑粒小麥資源的籽粒淀粉組分

對(duì)43份黑粒小麥資源的淀粉組分含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，11份SGP-A1缺失材料中，直鏈淀粉含量占總淀粉含量的比例超過30%的材料有5份，分別為黑初8、黑小麥76、黑初2、黑初27和冀紫439，占SGPA1缺失材料總數(shù)的45.45%；而其余的32份含有SGPA1材料中，直鏈淀粉含量占總淀粉量的比例超過30%的材料僅2份，分別為蘭粒D87063和14928（AUS），占含SGP-A1材料總數(shù)的6.25%。由此可見，在黑粒小麥資源中，從SGP-A1缺失材料獲得高直鏈淀粉含量的概率更大。

共對(duì)12份材料進(jìn)行了抗性淀粉含量檢測，結(jié)果（表2）顯示，5份黑粒小麥材料（冀紫439、黑初8、黑初27、黑初2和蘭粒D87063）的抗性淀粉含量＞10%，顯著高于其他材料。

表1 43份黑粒小麥材料的SGP-1缺失情況及其淀粉含量Table 1 The composition of SGP-1 and starch content of 43 black wheat germplasms

3 結(jié)論與討論

小麥SGP-1突變?nèi)笔?huì)直接導(dǎo)致胚乳中淀粉組分發(fā)生改變[8]。相關(guān)研究表明，SGP-1缺失增加了短鏈支鏈淀粉含量，而短鏈支鏈淀粉含量表現(xiàn)出直鏈淀粉的特性，從而在表型上直鏈淀粉含量因SGP-1缺失而增加，即表觀直鏈淀粉含量升高[8]。這種情況也出現(xiàn)在了高直鏈淀粉的玉米中[12]。在本研究的43份黑粒小麥資源中，45.45%的SGP-A1缺失材料直鏈淀粉含量占總淀粉含量的比例高于30%；而普通材料中，僅有6.25%的材料高直鏈淀粉含量占總淀粉含量的比例超過30%。該規(guī)律與前人研究結(jié)果相一致。

表2 12份不同材料的抗性淀粉含量Table 2 The resistant starch content of 12 black wheat germplasms

從供試的43份黑粒小麥資源中共鑒定出缺失SGP-A1材料11份，無缺失SGP-B1和SGP-D1材料，為小麥高附加值育種奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)；直鏈淀粉含量占淀粉總量的比例超過30%的材料有7份，其中，農(nóng)藝性狀比較好的材料有黑初8、黑初2和黑初27等；選擇12份材料進(jìn)行抗性淀粉含量測定，發(fā)現(xiàn)高抗性淀粉含量的材料有5份，分別為冀紫439、黑初8、黑初27、黑初2和蘭粒D87063。