李 揚(yáng)，張朝紅，于秋香，李 杰，張獻(xiàn)輝

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹研究所，河北 昌黎 066600；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院林園研究所，新疆 石河子 832000）

棗黑斑病最早于1985年發(fā)現(xiàn)[1]，1996年在山西棗區(qū)暴發(fā)流行[2]，近年來在新疆、云南、山東、河北和河南等地普遍發(fā)生[3，4]，給當(dāng)?shù)貤椶r(nóng)及棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成了重大損失。目前，棗黑斑病的防治以噴施化學(xué)藥劑為主，而連年施用化學(xué)農(nóng)藥易產(chǎn)生抗藥性、發(fā)生藥物殘留等問題[3，5]。

減少或避免使用化學(xué)農(nóng)藥，減輕環(huán)境污染，保障食品安全和發(fā)展有機(jī)農(nóng)業(yè)是我國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要方向[5，6]。生物防治是通過植物、病原物、生防菌、植物表面及其周圍微生物群落和自然環(huán)境等因素的相互作用，達(dá)到防治病害的目的。自1914年開始，生物防治受到關(guān)注，現(xiàn)已成為植保研究的熱點之一。采用拮抗微生物來防治植物病害是植物病害防控的一個重要手段[7]。以前期篩選的拮抗菌——解淀粉芽孢桿菌ZJ01為試材，研究其對棗黑斑病菌的抑制效果，以期為棗黑斑病的生物防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：解淀粉芽孢桿菌ZJ01（序列號HQ910433），由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中國棗研究中心提供，從健康棗葉片中分離獲得[8]；棗黑斑病菌LG（LG），由塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院提供。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、瓊脂14 g、葡萄糖20 g和蒸餾水1 L。NB培養(yǎng)液：蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、牛肉膏3 g/L和蒸餾水1 L。培養(yǎng)基和培養(yǎng)液的配制參照方中達(dá)的《植病研究方法》[9]，制作完成后在蒸汽高溫滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 解淀粉芽孢桿菌ZJ01對棗黑斑病菌菌落生長的抑制作用 將LG于25℃條件下在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，3～6 d后在菌落邊緣打取直徑6 mm的菌餅，接種于已滅菌的PDA培養(yǎng)基中心（培養(yǎng)皿直徑10 cm）。將解淀粉芽孢桿菌ZJ01于25℃條件下在PDA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，2～3 d后在菌落中央打取直徑6 mm的菌餅，接種于LG兩側(cè)2 cm處；以未接種解淀粉芽孢桿菌ZJ01的LG培養(yǎng)基作為對照。5次重復(fù)。于25℃條件下培養(yǎng)8 d后，測量菌落半徑以及趨向半徑，計算被抑制率〔%，（對照菌落半徑-處理菌落半徑）/對照菌落半徑×100%〕。同時，挑取對照和對峙區(qū)域帶菌落的培養(yǎng)基，在顯微鏡下觀察LG菌落菌絲的形態(tài)變化。

1.2.2 解淀粉芽孢桿菌ZJ01對棗黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制作用 將LG于25℃條件下在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，加入5 mL無菌水沖洗，用移液槍吸取沖洗液后用事先已經(jīng)滅菌的紗布過濾得到LG孢子懸浮液，濃度達(dá)1×107個/mL。

將解淀粉芽孢桿菌ZJ01接種于NB培養(yǎng)液中，于28℃搖床上振蕩培養(yǎng)48 h，獲得解淀粉芽孢桿菌ZJ01發(fā)酵液。將解淀粉芽孢桿菌ZJ01發(fā)酵液在4℃、10 000 r/min條件下離心15 min，取其上清液，經(jīng)細(xì)菌過濾器抽濾后得到含有解淀粉芽孢桿菌ZJ01代謝產(chǎn)物的無菌發(fā)酵原液；然后，分別稀釋0倍、2倍、4倍和8倍，得到4種不同濃度的無菌發(fā)酵液。

吸取NB無菌培養(yǎng)液（CK）和4種不同濃度的解淀粉芽孢桿菌ZJ01無菌發(fā)酵液各40 μL，分別滴入載玻片的凹槽中，晾干后再分別滴入40 μL的LG孢子懸浮液，3次重復(fù)。于25℃條件下保濕培養(yǎng)24 h后，在顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)情況[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌ZJ01對棗黑斑病菌LG菌落生長的抑制作用

2.1.1 對菌落生長的抑制 解淀粉芽孢桿菌ZJ01與棗黑斑病菌LG平板對峙培養(yǎng)4 d時，LG菌落出現(xiàn)抑制區(qū)域；培養(yǎng)至8 d時，抑制區(qū)域較為明顯，LG的被抑制率達(dá)到53.3%（圖1）。

圖1 解淀粉芽孢桿菌ZJ01對棗黑斑病菌LG菌落生長的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of B.amyloliquefuciens ZJ01 on the colony of A.alternata LG

2.1.2 對菌絲生長的抑制 培養(yǎng)8 d后，對照培養(yǎng)的棗黑斑病菌LG菌絲依然平滑，沒有出現(xiàn)異常變化（圖2-A、2-B）；對峙區(qū)的棗黑斑病菌LG菌絲生長受到明顯抑制，表現(xiàn)為菌絲頂端膨大（圖2-C、2-D）、異常產(chǎn)孢（圖2-D、2-E），原生質(zhì)發(fā)生割裂（圖2-F）等。

圖2 解淀粉芽孢桿菌ZJ01對棗黑斑病菌LG菌絲形態(tài)的影響Fig.2 Effect of B.amyloliquefuciens ZJ01 on the shape of A.alternata LG mycelium

2.2 解淀粉芽孢桿菌ZJ01對棗黑斑病菌LG孢子萌發(fā)的抑制作用

通過顯微鏡觀察凹面載玻片上棗黑斑病菌LG孢子的萌發(fā)情況發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌ZJ01的代謝物對棗黑斑病菌LG孢子萌發(fā)具有明顯的抑制作用（圖3）。其中，CK處理的棗黑斑病菌LG孢子萌發(fā)產(chǎn)生了大量的網(wǎng)狀菌絲（圖3-A）；而解淀粉芽孢桿菌ZJ01無菌發(fā)酵液處理的棗黑斑病菌LG孢子仍清晰可見，且多數(shù)孢子上產(chǎn)生了圓形小泡，僅有少量孢子產(chǎn)生了萌發(fā)管，且萌發(fā)管長度與孢子大小相當(dāng)（圖3-B~E）。說明解淀粉芽孢桿菌ZJ01的代謝物抑制了棗黑斑病菌LG的孢子萌發(fā)及菌絲生長。

圖3 解淀粉芽孢桿菌ZJ01對棗黑斑病菌LG孢子萌發(fā)的影響Fig.3 Effect of B.amyloliquefuciens ZJ01 on the spores germination of A.alternata LG

3 結(jié)論與討論

芽孢桿菌對病原菌形態(tài)產(chǎn)生的影響包括菌絲破裂[11]、壞死、液泡狀膨大、過度膨大等[12]。本研究結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌ZJ01會誘導(dǎo)棗黑斑病菌LG菌絲過度膨大、產(chǎn)生割裂形態(tài)和異常產(chǎn)孢。從形態(tài)上明確了解淀粉芽孢桿菌ZJ01對棗黑斑病菌的抑制作用。對于異常產(chǎn)孢后，其孢子的生活力如何、能否正常萌發(fā)還有待進(jìn)一步研究。

自然條件下棗黑斑病以鏈格孢菌孢子的形式侵染，因此，解淀粉芽孢桿菌ZJ01抑制棗黑斑病菌孢子萌發(fā)就成為防控棗黑斑病的關(guān)鍵之一。通過對解淀粉芽孢桿菌ZJ01無菌發(fā)酵液與棗黑斑病菌LG進(jìn)行玻片對峙培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌ZJ01的代謝產(chǎn)物能明顯抑制棗黑斑病菌LG孢子的萌發(fā)。今后，對于解淀粉芽孢桿菌無菌發(fā)酵液抑菌的最佳使用濃度還有待進(jìn)一步研究。