程三紅，湯海青，歐昌榮,*，張夢(mèng)思，昝春蘭，李亞敏

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.浙江醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校食品學(xué)院，浙江 寧波 315100）

魚(yú)類(lèi)由于高營(yíng)養(yǎng)、高水分及接近中性的pH值特點(diǎn)使其在流通運(yùn)輸中極易受微生物活動(dòng)和代謝的影響而腐敗變質(zhì)[1]。鮮活健康的魚(yú)類(lèi)肌肉組織內(nèi)部無(wú)菌，但在其體表、腮和消化道內(nèi)存在大量微生物，魚(yú)類(lèi)死亡后，這些微生物逐漸侵入魚(yú)體進(jìn)行繁殖和代謝，產(chǎn)生氨、胺類(lèi)、硫化物、酯、酮、醛和揮發(fā)性脂肪酸等物質(zhì)，引起魚(yú)體腐敗[2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)魚(yú)類(lèi)腐敗起主導(dǎo)作用的微生物通常只有一種或幾種，即特定腐敗菌[3]。目前，魚(yú)類(lèi)特定腐敗菌的研究多集中在肌肉微生物方面[4-5]，關(guān)于其體表微生物的研究則相對(duì)較少。然而，研究表明，魚(yú)類(lèi)體表微生物對(duì)魚(yú)體腐敗起著至關(guān)重要的作用[6]。因此，分析魚(yú)類(lèi)體表微生物組成及其代謝功能的變化對(duì)控制魚(yú)類(lèi)腐敗具有重要意義。

隨著科技的進(jìn)步，以Illumina、Roche 454和Ion Torrent等測(cè)序系統(tǒng)為代表的高通量測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展[7]，已成為微生物群落研究的重要工具。部分學(xué)者將其應(yīng)用于熏鮭魚(yú)[8]、黃鰭金槍魚(yú)[9]、牡蠣[10]和蝦[11]等水產(chǎn)食品微生物群落的研究，以揭示水產(chǎn)食品的優(yōu)勢(shì)腐敗微生物。但國(guó)內(nèi)外利用該技術(shù)對(duì)魚(yú)類(lèi)體表微生物進(jìn)行的研究卻比較少見(jiàn)。

此外，現(xiàn)有研究主要關(guān)注魚(yú)類(lèi)腐敗細(xì)菌群落組成，缺乏其代謝相關(guān)的功能信息。PICRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）是一項(xiàng)基于16S序列預(yù)測(cè)細(xì)菌群落功能的軟件[12]。Stellato等[13]采用PICRUSt對(duì)肉類(lèi)及其相關(guān)的環(huán)境樣本細(xì)菌群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落和預(yù)測(cè)的代謝功能之間具有相關(guān)性。Ferrocino等[14]對(duì)不同包裝的牛肉漢堡微生物進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)采用乳酸鏈球菌素抗菌包裝能夠降低樣品中腐敗相關(guān)的代謝功能基因的豐度，延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期。由此可見(jiàn)，采用PICRUSt功能預(yù)測(cè)可以將細(xì)菌群落與其代謝功能聯(lián)系起來(lái)，更好地闡述食品加工貯藏過(guò)程中細(xì)菌群落組成、代謝功能和腐敗變質(zhì)之間的關(guān)系。

鮐魚(yú)（Pneumatophorus japonica）和大黃魚(yú)（Pseudosciaena crocea）是我國(guó)重要的海水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，在水產(chǎn)市場(chǎng)占有較大份額。然而，鮐魚(yú)屬于紅肉魚(yú)類(lèi)，大黃魚(yú)屬于白肉魚(yú)類(lèi)，紅肉魚(yú)為適應(yīng)持續(xù)的洄游運(yùn)動(dòng)，常含有較多的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖和酶等。因此，同一貯藏條件下，鮐魚(yú)往往比大黃魚(yú)更容易受生理生化和微生物等因素影響而腐敗變質(zhì)[15]。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)選取鮐魚(yú)和大黃魚(yú)為研究對(duì)象，采用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)和PICRUSt功能預(yù)測(cè)來(lái)比較分析鮐魚(yú)和大黃魚(yú)冷藏期間體表細(xì)菌群落和代謝功能的差異，揭示兩種魚(yú)的特定腐敗微生物，并探討鮐魚(yú)更容易腐敗的原因，以期為靶向抑制水產(chǎn)品的腐敗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮐魚(yú)和大黃魚(yú)由寧波夢(mèng)婕食品有限公司提供。其中，鮐魚(yú)（體質(zhì)量250～300 g，體長(zhǎng)25～30 cm）捕獲于中國(guó)東海海域，大黃魚(yú)（體質(zhì)量400～450 g，體長(zhǎng)30～35 cm）為寧波象山港海域深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚(yú)。

細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒、λ DNA/Hind Ⅲ北京天根公司；Gelview核酸染料 北京百泰克公司；6×Loading Buffer、瓊脂糖 北京全式金公司；溶菌酶、50×TAE 北京索萊寶公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H1850R高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)、新JY300C電泳儀、JY-SPCT電泳槽 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；ND-1000分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Scientific公司；MiSeq測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

鮐魚(yú)和大黃魚(yú)捕獲后，在船上用無(wú)菌袋單獨(dú)包裝，層冰層魚(yú)置于冰盒中12 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，分別隨機(jī)分成4 組，于4 ℃冰箱冷藏。取樣測(cè)定時(shí)間分別為第0、3、6、9天（鮐魚(yú)和大黃魚(yú)分別記為：T0、T3、T6、T9和H0、H3、H6、H9），每個(gè)取樣點(diǎn)各取6 尾鮐魚(yú)和大黃魚(yú)進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 TVB-N含量的測(cè)定

參照國(guó)家水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3032—2007《水產(chǎn)品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[16]測(cè)定揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）的含量，取魚(yú)體背部肌肉進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行。

1.3.3 基因組DNA提取

魚(yú)類(lèi)體表微生物收集參考Ozaktas等[17]的方法進(jìn)行。用無(wú)菌棉球沿魚(yú)體背部中線長(zhǎng)度約8 cm的表皮進(jìn)行擦拭，兩側(cè)擦拭面積共約30 cm2，同時(shí)避開(kāi)腹部和腮部以免腸道和腮部微生物污染。將棉球置于10 mL無(wú)菌離心管中，加入2 mL 8.5 g/L無(wú)菌生理鹽水，高速漩渦2 min，吸出菌懸液置于2 mL離心管中，4 ℃、10 000×g離心20 min，收集沉淀。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取。質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，ND-1000分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度。DNA樣本于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 PCR擴(kuò)增和測(cè)序

使用1 6 S r R N A基因引物3 4 1 F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4高變區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。

PCR條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，33 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。每個(gè)樣品設(shè)計(jì)3 個(gè)平行進(jìn)行PCR擴(kuò)增以減少擴(kuò)增造成的偏差。經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物片段大小符合預(yù)期結(jié)果，且沒(méi)有非特異性條帶，用PCR片段純化試劑盒純化。使用ND-1000分光光度計(jì)測(cè)定濃度，每個(gè)樣品取等量的PCR產(chǎn)物混合，用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)測(cè)序。

1.3.5 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用FLASH軟件（version1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接；使用QIIME（version 1.9.0，http://qiime.org/）進(jìn)行質(zhì)控和去除嵌合體序列（Chimera sequence）[18]，用Uclust在97%相似性水平上將序列聚類(lèi)成操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTUs）[19]；選取豐度和覆蓋度最高的序列作為每個(gè)OTU的代表序列，用PyNAST在Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)進(jìn)行物種注釋[20]；去除古菌、葉綠體和非細(xì)菌序列及僅有一條序列的OTUs[21]。為消除樣品間由于測(cè)序深度不同造成的偏差，對(duì)每個(gè)樣品隨機(jī)選取23 330 條（最低測(cè)序深度）序列用于后續(xù)分析。利用PICRUSt （http://picrust.github.io/picrust/）工具將OTU表標(biāo)準(zhǔn)化并與KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析[12]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用QIIME軟件計(jì)算Chao 1和系統(tǒng)發(fā)育指數(shù)；用R軟件（v.3.1.1）中vegan軟件包計(jì)算細(xì)菌群落香農(nóng)指數(shù)；參考Andersson等[22]計(jì)算測(cè)序深度指數(shù)；使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；利用PAST軟件基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）評(píng)估各樣本細(xì)菌群落的差異性；利用PAST軟件的群落相似性分析檢測(cè)兩種魚(yú)體表菌群結(jié)構(gòu)的差異及差異顯著性[23]。利用Pearson相關(guān)性分析篩選與TVB-N含量相關(guān)的細(xì)菌屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌群落多樣性分析

對(duì)48 個(gè)樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序。其中，H0樣品經(jīng)PCR后未能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，可能是由于冷藏初期大黃魚(yú)體表細(xì)菌較少，導(dǎo)致提取的DNA濃度過(guò)低或者未抽提出；因此在后續(xù)數(shù)據(jù)處理中去除了對(duì)H0樣品的分析。其他42 個(gè)樣品經(jīng)拼接、過(guò)濾處理后，共得到1 308 492 條序列，平均每個(gè)樣本得到（31 154±2 760）條序列。每個(gè)樣品隨機(jī)選取23 330 條序列計(jì)算鮐魚(yú)和大黃魚(yú)冷藏期間體表細(xì)菌群落豐富度和多樣性（表1）。Chao1指數(shù)表征物種豐富度，Chao1指數(shù)越大，物種豐富度越高；觀察到的物種數(shù)表征樣品中含有的物種數(shù)目，觀察到的物種數(shù)值越大，物種豐富度越高；香農(nóng)指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育指數(shù)則表征菌群多樣性，其值越大，群落多樣性就越高。結(jié)果表明，鮐魚(yú)體表細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)和觀測(cè)到的物種數(shù)總體上均隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，但其細(xì)菌群落的香農(nóng)指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育指數(shù)則隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著下降（P＜0.05）；從冷藏第3～9天，大黃魚(yú)體表細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)、觀測(cè)到的物種數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育指數(shù)變化均不顯著（P＞0.05）。本研究中，所有樣本測(cè)序深度指數(shù)均在97%以上，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果能夠反映樣品中絕大多數(shù)微生物信息。

表 1 單因素方差分析鮐魚(yú)和大黃魚(yú)冷藏期間體表細(xì)菌群落多樣性Table 1 One-way ANOVA analysis for the diversity of bacterial communities on mackerel and large yellow croaker during refrigerated storage

2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成分析

在門(mén)水平上，鮐魚(yú)和大黃魚(yú)體表細(xì)菌主要隸屬于6 個(gè)門(mén)（圖1a，平均相對(duì)豐度均大于1%）。其中，變形菌門(mén)（Proteobacteria）在兩種魚(yú)體表均占優(yōu)勢(shì)地位，其次是厚壁菌門(mén)（Firmicute）。變形菌門(mén)相對(duì)豐度在鮐魚(yú)體表隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，冷藏末期達(dá)到99.8%，但在大黃魚(yú)體表卻呈下降趨勢(shì)；與之相反，厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度在鮐魚(yú)冷藏前期處于較高水平，后期則急劇下降，但在大黃魚(yú)體表卻隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)。

在屬水平上，鮐魚(yú)和大黃魚(yú)體表菌相差異較大（圖1b，平均相對(duì)豐度均大于1%）。冷藏初期，鮐魚(yú)體表菌相以嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）為主。冷藏過(guò)程中，鮐魚(yú)和大黃魚(yú)體表優(yōu)勢(shì)細(xì)菌分別以嗜冷桿菌屬和希瓦氏菌屬（Shewanella）為主。嗜冷桿菌屬在鮐魚(yú)體表始終處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，并隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而上升；希瓦氏菌屬在大黃魚(yú)冷藏第3～6天大幅上升，其后略微下降。鮐魚(yú)體表次要微生物為葡萄球菌屬和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）等。葡萄球菌屬和不動(dòng)桿菌屬在鮐魚(yú)冷藏前期有較高分布，后期則處于較低水平。大黃魚(yú)體表次要細(xì)菌為發(fā)光桿菌屬（Photobacterium），僅在大黃魚(yú)冷藏第3天有較高分布，后期逐漸下降。其他細(xì)菌屬在鮐魚(yú)和大黃魚(yú)冷藏期間相對(duì)豐度始終處于較低水平。

圖 1 鮐魚(yú)和大黃魚(yú)冷藏期間體表細(xì)菌在門(mén)（a）和屬（b）水平上的平均相對(duì)豐度Fig. 1 Average relative abundance of bacterial communities on mackerel and large yellow croaker at the phylum (a) and genus (b) levels during refrigerated storage

利用PCoA分析鮐魚(yú)和大黃魚(yú)體表細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，圖中各樣品之間的相對(duì)距離能夠反映其細(xì)菌群落的相似程度，距離越近，相似性越高，結(jié)果顯示不同魚(yú)種之間的體表菌群差異性總體上隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加（圖2a）。此外，同種魚(yú)的6 個(gè)平行樣本之間的體表菌群差異性卻隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減?。▓D2b、c）。細(xì)菌群落相似性檢驗(yàn)表明鮐魚(yú)和大黃魚(yú)之間的體表細(xì)菌群落組成具有高度顯著差異（P＜0.001）；冷藏期間，除鮐魚(yú)樣品在0 d和3 d之間以及大黃魚(yú)在6 d和9 d之間差異不顯著外，同種魚(yú)的其他樣品之間均具有極顯著差異（P＜0.01）（表2）。

圖 2 鮐魚(yú)和大黃魚(yú)冷藏期間體表細(xì)菌群落主坐標(biāo)分析Fig. 2 Principal coordinate analysis for bacterial communities on mackerel and large yellow croaker during refrigerated storage

表 2 基于Bray-Curtis距離的鮐魚(yú)和大黃魚(yú)冷藏期間體表細(xì)菌群落差異性分析Table 2 Community dissimilarity based on the analysis of similarity using Bray-Curtis distance of bacterial communities on mackerel and large yellow croaker during refrigerated storage

2.3 與TVB-N含量相關(guān)的細(xì)菌篩選

圖 3 鮐魚(yú)和大黃魚(yú)冷藏期間TVB-N含量的變化Fig. 3 Change in TVB-N contents of mackerel and large yellow croaker during refrigerated storage

如圖3所示，整個(gè)冷藏期間鮐魚(yú)和大黃魚(yú)TVB-N含量均隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，且鮐魚(yú)的TVB-N含量極顯著高于同一冷藏時(shí)期的大黃魚(yú)（P＜0.001）。冷藏末期鮐魚(yú)TVB-N含量已超出GB 2733—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》中規(guī)定的海水魚(yú)的最高限值（30 mg/100 g）[24]，而大黃魚(yú)仍處于限值范圍內(nèi)?？梢?jiàn)，同一冷藏條件下鮐魚(yú)比大黃魚(yú)更易分解產(chǎn)生TVB-N，腐敗速度更快。

表 3 鮐魚(yú)和大黃魚(yú)冷藏期間體表細(xì)菌群落相對(duì)豐度 與TVB-N含量相關(guān)性Table 3 Correlation between relative abundance and TVB-N content on mackerel and large yellow croaker during refrigerated storage

在屬水平利用Pearson相關(guān)性分別檢驗(yàn)鮐魚(yú)和大黃魚(yú)體表細(xì)菌群落相對(duì)豐度與TVB-N含量的相關(guān)性，挑出相對(duì)豐度＞1%、r＞0.5且P＜0.05的TVB-N相關(guān)細(xì)菌，結(jié)果見(jiàn)表3。鮐魚(yú)體表篩選到與TVB-N含量顯著相關(guān)的細(xì)菌共10 種，其中與TVB-N含量呈正相關(guān)的有嗜冷桿菌屬和弧菌屬。大黃魚(yú)體表篩選到與TVB-N含量顯著相關(guān)的細(xì)菌共2 種，其中與TVB-N含量呈正相關(guān)的主要是希瓦氏菌屬。

2.4 PICRUSt功能預(yù)測(cè)

將鮐魚(yú)和大黃魚(yú)體表細(xì)菌群落進(jìn)行PICRUSt功能預(yù)測(cè)，共獲得296 種預(yù)測(cè)功能基因，其中與代謝相關(guān)的基因主要是氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、輔酶因子及維生素代謝、脂質(zhì)代謝和核酸代謝相關(guān)基因等。線性回歸分析顯示，鮐魚(yú)（r＝0.809，P＜0.001）和大黃魚(yú)（r＝0.771，P＜0.001）的體表細(xì)菌群落相似性與功能相似性之間均顯著正相關(guān)（圖4）。將氨基酸、脂質(zhì)和碳水化合物代謝相關(guān)基因的相對(duì)豐度分布特征繪制成熱圖（圖5）（平均相對(duì)豐度＞0.1%），發(fā)現(xiàn)鮐魚(yú)和大黃魚(yú)體表細(xì)菌代謝相關(guān)基因基本能夠按照不同魚(yú)種聚成兩類(lèi)，但鮐魚(yú)在冷藏0 d時(shí)與大黃魚(yú)聚成一類(lèi)，這表明冷藏初期鮐魚(yú)體表細(xì)菌代謝相關(guān)基因的相對(duì)豐度與大黃魚(yú)類(lèi)似，但中后期則差異較大。冷藏期間，鮐魚(yú)和大黃魚(yú)體表均有氨基酸、脂質(zhì)和碳水化合物代謝相關(guān)基因的分布，且氨基酸代謝相關(guān)基因的相對(duì)豐度占據(jù)比例最大。鮐魚(yú)體表細(xì)菌的半胱氨酸、蛋氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸等參與氨基酸代謝的基因相對(duì)豐度總體上隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，而大黃魚(yú)則表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。此外，鮐魚(yú)體表細(xì)菌的蛋氨酸、酪氨酸、組氨酸等絕大部分參與氨基酸代謝相關(guān)基因的相對(duì)豐度顯著高于同一冷藏時(shí)期的大黃魚(yú)（P＜0.05）。

圖 4 鮐魚(yú)（a）和大黃魚(yú)（b）冷藏期間體表細(xì)菌群落相似性與功能相似性的擬合相關(guān)性Fig. 4 Correlation between composition and functional similarity of bacterial communities on mackerel (a) and large yellow croaker (b)during refrigerated storage

圖 5 鮐魚(yú)和大黃魚(yú)冷藏期間體表細(xì)菌群落的氨基酸、脂質(zhì)和碳水化合物代謝相關(guān)基因豐度分布熱圖Fig. 5 Heatmap of the abundance of genes related to amino acid metabolism, lipid metabolism, and carbohydrate metabolism in bacterial communities on mackerel and large yellow croaker during refrigerated storage

3 討 論

高通量測(cè)序技術(shù)能夠更真實(shí)、更全面地反映樣本中微生物群落信息，本研究采用Illumina測(cè)序技術(shù)和PICRUSt功能預(yù)測(cè)比較分析了鮐魚(yú)和大黃魚(yú)冷藏期間體表細(xì)菌群落組成和代謝功能的差異。冷藏期間鮐魚(yú)體表細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)和觀測(cè)到的物種數(shù)均隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，香農(nóng)指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育指數(shù)卻下降，說(shuō)明隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，鮐魚(yú)體表細(xì)菌群落豐富度上升，多樣性卻下降，表面細(xì)菌主要由優(yōu)勢(shì)菌構(gòu)成，這可能是菌群間的競(jìng)爭(zhēng)和抑制作用所致[25]。大黃魚(yú)在冷藏第0天未能抽提到DNA，可能是因?yàn)楹Ｋ形⑸餄舛容^低，同時(shí)其體表黏液中含有凝集素、溶菌酶和抗菌肽等抗菌成分[26]。大黃魚(yú)從冷藏第3～9天體表細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)、觀測(cè)到的物種數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育指數(shù)變化均不顯著，說(shuō)明其體表菌群豐富度和多樣性在該時(shí)期相對(duì)穩(wěn)定。

在門(mén)水平上，鮐魚(yú)和大黃魚(yú)體表主要優(yōu)勢(shì)菌為變形菌門(mén)。類(lèi)似的，Larsen等[27]對(duì)6 種墨西哥灣魚(yú)類(lèi)體表微生物進(jìn)行研究，也發(fā)現(xiàn)變形菌門(mén)是其體表優(yōu)勢(shì)菌。變形菌門(mén)廣泛分布于海洋環(huán)境中，而魚(yú)類(lèi)體表細(xì)菌主要來(lái)自其周?chē)乃h(huán)境[28]。本研究中，大黃魚(yú)采用深水網(wǎng)箱模式進(jìn)行養(yǎng)殖，其生存環(huán)境高度模擬海水環(huán)境。因此，在細(xì)菌門(mén)水平，其體表菌相和鮐魚(yú)等海水魚(yú)類(lèi)相似。

在屬水平上，兩種魚(yú)體表菌相差異較大。冷藏期間鮐魚(yú)體表優(yōu)勢(shì)菌始終以嗜冷桿菌屬為主。嗜冷桿菌屬是典型的耐寒性細(xì)菌，在多種水產(chǎn)品中均有檢出[29]。本研究中，嗜冷桿菌屬的相對(duì)豐度與鮐魚(yú)TVB-N含量顯著正相關(guān)。張?chǎng)30]通過(guò)對(duì)無(wú)菌魚(yú)肉進(jìn)行接種研究，發(fā)現(xiàn)嗜冷桿菌屬中的靜止嗜冷桿菌（Psychrobacter immobilis）具有產(chǎn)三甲胺（trimethylamine，TMA）和TVB-N的能力。由此推測(cè)，嗜冷桿菌屬可能是鮐魚(yú)體表的特定腐敗菌。此外，鮐魚(yú)體表的弧菌屬也與其TVB-N含量顯著正相關(guān)，弧菌屬種類(lèi)較多，分解蛋白能力較強(qiáng)[10]，但弧菌屬多屬于嗜溫菌，低溫能夠抑制嗜溫菌的生長(zhǎng)。因此，弧菌屬在冷藏期間相對(duì)豐度始終處于較低水平[31]。根據(jù)這一結(jié)果，在鮐魚(yú)加工貯藏過(guò)程中，可采用抑制嗜冷桿菌屬繁殖的方法對(duì)其進(jìn)行處理，從而延長(zhǎng)鮐魚(yú)貨架期。例如：張?chǎng)┑萚32]通過(guò)對(duì)峙實(shí)驗(yàn)和擴(kuò)散抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌BS08對(duì)分離自魚(yú)體的嗜冷桿菌屬具有強(qiáng)烈抑制作用。因此，可采用該益生菌對(duì)鮐魚(yú)進(jìn)行處理來(lái)延緩魚(yú)體腐敗。

從冷藏第3～9天，大黃魚(yú)體表主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為希瓦氏菌屬，這可能與希瓦氏菌屬具有較強(qiáng)的低溫耐受性有關(guān)[33]。希瓦氏菌屬是海水魚(yú)類(lèi)常見(jiàn)的腐敗菌[34]。大量研究表明，希瓦氏菌屬能還原氧化三甲胺（trimetlylamine oxide，TMAO）為T(mén)MA，并能生成H2S，使魚(yú)體出現(xiàn)酸臭味[3]。本研究中，希瓦氏菌屬的相對(duì)豐度亦與大黃魚(yú)TVB-N含量呈顯著正相關(guān)；因此，希瓦氏菌屬可能是大黃魚(yú)體表的特定腐敗菌。值得注意的是，本研究中，嗜冷桿菌屬與鮐魚(yú)TVB-N含量表現(xiàn)出正相關(guān)性，卻與大黃魚(yú)TVB-N含量表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性，這可能是因?yàn)轷T魚(yú)體表嗜冷桿菌屬具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，因而其相對(duì)豐度隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升；相反的，大黃魚(yú)體表嗜冷桿菌屬在冷藏中后期可能受到乳酸菌分泌的過(guò)氧化氫、乳酸和細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)的抑制[35]，其相對(duì)豐度隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。為延長(zhǎng)大黃魚(yú)的貨架期，可針對(duì)希瓦氏菌屬采取一些抑菌措施。例如：He Mu等[36]采用10 g/L殼聚糖和6 g/L Nisin結(jié)合的保鮮劑對(duì)大黃魚(yú)魚(yú)肉進(jìn)行浸泡處理，發(fā)現(xiàn)該保鮮劑能有效抑制魚(yú)肉中希瓦氏菌的生長(zhǎng)和生物膜的形成，從而減少魚(yú)肉氨基酸的分解及腐敗產(chǎn)物的生成，達(dá)到保鮮效果。

魚(yú)類(lèi)腐敗細(xì)菌的繁殖常伴隨著大量代謝產(chǎn)物的生成；因此，魚(yú)類(lèi)菌群結(jié)構(gòu)在魚(yú)體代謝產(chǎn)物形成方面起著重要作用。某些微生物在功能上有一定的相似性，當(dāng)其中一種或幾種微生物被去除后，細(xì)菌群落功能能基本保持不變，即微生物群落存在功能冗余[37]。本研究中，兩種魚(yú)體表細(xì)菌群落相似性與功能相似性之間均顯著正相關(guān)，表明菌群功能冗余度相對(duì)較低[38]。鮐魚(yú)體表細(xì)菌的氨基酸代謝相關(guān)基因的相對(duì)豐度隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，大黃魚(yú)卻呈現(xiàn)出相反趨勢(shì)，這可能與兩種魚(yú)體表細(xì)菌代謝能力隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而有不同的變化有關(guān)。冷藏初期，鮐魚(yú)處于僵硬期，魚(yú)肉pH值下降，酸性環(huán)境不適宜細(xì)菌的繁殖代謝，中后期隨著氨和胺類(lèi)堿性物質(zhì)的累積，pH值上升，細(xì)菌的分解代謝能力逐漸增強(qiáng)[15]；而大黃魚(yú)體表細(xì)菌在冷藏中后期可能受到乳酸菌的抑制，分解代謝能力逐漸減弱[35]。同時(shí)這也解釋了冷藏第0天鮐魚(yú)體表細(xì)菌代謝相關(guān)基因的相對(duì)豐度與大黃魚(yú)類(lèi)似，中后期則差異較大的原因。

魚(yú)肉的腐敗主要與蛋白質(zhì)、氨基酸等的分解有關(guān)。在細(xì)菌作用下，蛋氨酸和酪氨酸分解易生成含氮物質(zhì)，使魚(yú)體TVB-N含量升高[39]；組氨酸分解則生成組胺，影響?hù)~(yú)類(lèi)食用安全[5]；色氨酸分解生成吲哚、甲基吲哚等，使魚(yú)體產(chǎn)生異味[40]。一方面，鮐魚(yú)體表細(xì)菌的蛋氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸等絕大部分參與氨基酸代謝的相關(guān)基因的相對(duì)豐度顯著高于同一冷藏時(shí)期的大黃魚(yú)；另一方面，鮐魚(yú)皮膚細(xì)薄、易破肚，體表細(xì)菌極易侵入，且肌肉松軟，富含組氨酸等游離氨基酸[15]。因此，當(dāng)鮐魚(yú)體表細(xì)菌侵入內(nèi)部后，其氨基酸更易分解代謝產(chǎn)生TVB-N和組胺等不良物質(zhì)，使魚(yú)體腐敗。研究表明，鮐魚(yú)屬于典型的高組胺魚(yú)類(lèi)[5]，本研究中鮐魚(yú)體表組氨酸代謝相關(guān)基因的相對(duì)豐度顯著高于大黃魚(yú)，這與鮐魚(yú)更易產(chǎn)生組胺的特性一致。說(shuō)明PICRUSt功能預(yù)測(cè)軟件在組胺相關(guān)菌的研究上表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，可為組胺相關(guān)菌的研究提供新思路，相關(guān)研究值得進(jìn)一步探討。此外，鮐魚(yú)體表的脂質(zhì)和碳水化合物代謝相關(guān)基因的相對(duì)豐度也較高。在相關(guān)微生物作用下，鮐魚(yú)比大黃魚(yú)更易進(jìn)行脂質(zhì)和碳水化合物代謝產(chǎn)生醛、酮和酸等物質(zhì)[41]，使魚(yú)體產(chǎn)生腥臭味，品質(zhì)劣化。

4 結(jié) 論

冷藏期間，鮐魚(yú)體表細(xì)菌群落的豐富度隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，多樣性卻下降；大黃魚(yú)體表細(xì)菌群落的豐富度和多樣性變化均不顯著。鮐魚(yú)和大黃魚(yú)體表的特定腐敗菌可能分別是嗜冷桿菌屬和希瓦氏菌屬。與大黃魚(yú)相比，鮐魚(yú)體表細(xì)菌具有更高豐度的蛋氨酸、酪氨酸和組氨酸等參與氨基酸代謝的相關(guān)基因，這在一定程度上從微生物代謝水平解釋了鮐魚(yú)比大黃魚(yú)更易腐敗的原因。本研究可為魚(yú)類(lèi)針對(duì)性的貯藏保鮮技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供參考，為水產(chǎn)品加工貯藏過(guò)程中微生物組成及代謝功能變化的研究提供新思路。