劉 聰，孫偉靜，李 寧，高佳琪，于澤鵬，敬 舒，王春梅，孫靖輝，陳建光，李 賀,*

（1.北華大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132013）

隨著全球人口不斷老齡化，衰老人群日益增多。學(xué)習(xí)記憶能力減退與障礙是衰老人群的主要特征。研發(fā)具有輔助改善記憶功能的保健食品及藥物前景廣闊。本研究前期工作顯示，五味子總木脂素對D-半乳糖所致衰老小鼠具有顯著的改善記憶作用[1-2]。但該作用主要由哪些活性成分引起尚不清楚。五味子乙素（schisandrin B，SCB）是五味子木脂素中含量最高的聯(lián)苯環(huán)辛烯類單體化合物，是五味子中主要活性成分之一[3-4]。已有研究報道SCB具有較強(qiáng)的抗氧化性[5-8]，但目前鮮有SCB對D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響的相關(guān)研究。因此，本研究通過D-半乳糖建立小鼠衰老模型，探討SCB的改善記憶作用及相關(guān)機(jī)制，為開發(fā)輔助改善記憶功能的保健食品及藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級健康ICR小白鼠，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，由吉林大學(xué)實驗動物研究中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（吉）：2015-0005。小鼠采取分籠飼養(yǎng)，且維持12 h∶12 h晝夜循環(huán)，飼料供給充足，自由飲水。

SCB 四川省維克奇生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（分析純） 山東濰坊力特復(fù)合材料有限公司；二氧化鈦（分析純）、吐溫20（分析純） 天津永大試劑公司；D-半乳糖 美國S i g m a公司；HCl-Tris、30%丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨、Tris、甘氨酸 北京鼎國試劑公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、MDA試劑 南京建成生物工程研究所；脫脂奶粉 美國BD公司；p53蛋白、p21蛋白、p19蛋白 英國Abcam公司；ECL顯色液碧云天生物制品有限公司；RNA抽提試劑盒 美國Vazyme公司；SYBR Green Real-time 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Super Mix 美國Invitrogen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

infiniteM200全自動酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司；Western blot電泳儀、電轉(zhuǎn)儀及實時熒光定量（quantitative real-time PCR，qPCR）儀 美國Bio-Rad公司；ChampChemi Professional+全自動多色熒光及化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) 北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；DT-200小鼠避暗儀、MT-200 Morris水迷宮分析儀 成都泰盟科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及給藥

ICR小鼠隨機(jī)分為4 組，每組15 只。1）正常對照組（CON）組：每天灌胃蒸餾水及頸后皮下注射生理鹽水；2）衰老模型（MOD）組：每天灌胃蒸餾水及頸后皮下注射220 mg/kg D-半乳糖；3）SCB（M）組：每天灌胃20 mg/kg SCB，皮下注射220 mg/kg D-半乳糖；4）SCB（C）組：每天灌胃20 mg/kg SCB，皮下注射生理鹽水。

1.3.2 小鼠避暗實驗

將小鼠放入避暗儀中，面部背向洞口放入明室，從小鼠進(jìn)入洞口至其到達(dá)暗室的時間即為潛伏期。本實驗對小鼠訓(xùn)練5 min，記錄在5 min內(nèi)小鼠的錯誤次數(shù)。間隔24 h后進(jìn)行第二次實驗。記錄每只鼠的潛伏期以及在5 min內(nèi)出現(xiàn)的錯誤次數(shù)[9]。

1.3.3 Morris水迷宮實驗

將小鼠放在Morris水迷宮視頻跟蹤測試系統(tǒng)中，設(shè)置小鼠的訓(xùn)練時間設(shè)定為120 s，在120 s內(nèi)未達(dá)到終點(diǎn)的小鼠按120 s記錄。每隔24 h訓(xùn)練1 次，采集第5天的實驗數(shù)據(jù)。第一次實驗之前將小鼠放在平臺附近，使其自動爬上3 次。以后每次訓(xùn)練前將小鼠放在平臺附近，使其自主爬上到平臺一次。第6天把平臺去掉統(tǒng)計小鼠空間搜索能力。并記錄小鼠穿越平臺的次數(shù)和穿越有效區(qū)的次數(shù)[10]。

1.3.4 SCB對衰老小鼠體內(nèi)SOD活力和MDA含量的影響

從1.3.3節(jié)的各組中隨機(jī)選取10 只小鼠，在末次給藥后30 min后處死小鼠，取出腦組織及血清，應(yīng)用WST-1法檢測SOD活力，應(yīng)用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量。具體方法參照試劑盒說明書。

1.3.5 小鼠腦組織中p19、p53、p21基因表達(dá)的檢測

1.3.4節(jié)中小鼠末次給藥后30 min，每組取3 只小鼠腦組織，應(yīng)用試劑盒提取細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說明操作合成cDNA。按試劑盒說明進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，在GenBank里查找各基因序列號，采用Primer 6.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計，由北京鼎國昌盛生物工程公司合成，以β-actin為內(nèi)參基因，引物序列見表1。

表 1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

qPCR條件為95 ℃、10 min，1 個循環(huán)；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40 個循環(huán)。95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃、15 s，1 個循環(huán)，制備溶解曲線。采用2-△△Ct進(jìn)行相對定量。

1.3.6 Western blot法檢測腦組織中p19、p21及p53蛋白的表達(dá)情況1.3.4節(jié)中小鼠末次給藥后30 min，每組取3 只小鼠腦組織，加入裂解液，冰上裂解1 h，高速離心機(jī)離心取上清液。以二喹啉甲酸法測定組織蛋白濃度，以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳分離p19、p53、p21蛋白。2 h電轉(zhuǎn)移至聚丙二氟乙烯膜，取出膜在Tris緩沖液（TBS-T）中漂洗5 min，然后用封閉液封閉1 h（含5%脫脂奶粉的TBS-T）。室溫孵育后棄去封閉液，分別加入一抗p19（1∶1 000）、p53（1∶1 000）、p21（1∶1 000），4 ℃溫育過夜后，TBS-T洗5 次，每次5 min。加入二抗（1∶2 000）溫育2 h，TBS-T洗5 次，每次5 min，最后加入顯色液ECL顯色。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。避暗實驗中的潛伏期、錯誤次數(shù)、Morris水迷宮實驗中的穿越平臺、穿越有效區(qū)次數(shù)、在目標(biāo)象限停留時間及穿越平臺次數(shù)，小鼠腦組織中的SOD活力、MDA含量，qPCR和Western blot的實驗數(shù)據(jù)用±s表示，組間兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 避暗實驗觀察SCB對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

避暗實驗結(jié)果顯示，第2天的記憶測試中（圖1A），與CON組相比，MOD組小鼠潛伏期明顯縮短（P＜0.01），SCB（C）組小鼠未見明顯差異；與MOD組比較，SCB（M）組小鼠潛伏期明顯延長（P＜0.05）。如圖1B所示，與CON組相比，MOD組小鼠5 min內(nèi)錯誤次數(shù)明顯增多（P＜0.01），SCB（C）組小鼠未見明顯差異；與MOD組比較，SCB（M）組錯誤次數(shù)減少（P＜0.05）。以上結(jié)果提示SCB能夠提高D-半乳糖所致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

圖 1 避暗實驗觀察SCB對腦衰老小鼠潛伏期和錯誤次數(shù)的影響（n＝ 15）Fig. 1 Effect of SCB on learning and memory in aging mice in dark avoidance test (n = 15)

2.2 Morris水迷宮實驗觀察SCB對衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.2.1 定位航行實驗結(jié)果

圖 2 定位航行實驗中小鼠游泳潛伏期（n＝15）Fig. 2 Swimming latency of mice in orientation navigation test (n = 15)

定位航行實驗結(jié)果如圖2顯示，隨訓(xùn)練時間延長，各組小鼠找到平臺時間逐漸縮短。與CON組比較，MOD組小鼠在訓(xùn)練第4天（P＜0.05）及第5天（P＜0.01）找到平臺時間明顯延長；SCB（C）組未見明顯差異。與MOD組比較，在訓(xùn)練第5天，SCB（M）組小鼠找到平臺潛伏期明顯縮短（P＜0.05）。以上結(jié)果進(jìn)一步提示SCB能夠提高D-半乳糖所致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

2.2.2 空間搜索實驗結(jié)果

如圖3、4所示，與CON組比較，MOD組小鼠在平臺所在象限的停留時間明顯縮短（P＜0.01），穿過原平臺的次數(shù)減少（P＜0.05），SCB（C）組未見明顯差異。與MOD組相比，SCB（M）組在平臺所在象限的停留時間明顯延長（P＜0.05）。以上結(jié)果進(jìn)一步證實SCB能夠提高D-半乳糖所致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

圖 3 空間搜索實驗中SCB對腦衰老小鼠目標(biāo)象限停留時間及經(jīng)過平臺次數(shù)的影響（n ＝15）Fig. 3 Effect of SCB on the time spent in target quadrant and the number of platform crossing in aging mice in spatial probe test (n = 15)

圖 4 空間搜索實驗中小鼠游泳軌跡圖（n＝15）Fig. 4 Swimming trajectory of mice in spatial probe test (n = 15)

2.3 SCB對腦衰老小鼠腦組織SOD活力、MDA含量的影響

圖 5 SCB對腦衰老小鼠腦組織中SOD活力（A）及MDA含量（B）的影響（n＝15）Fig. 5 Effect of SCB on SOD activity (A) and MDA content (B) in the brain tissue of aging mice (n = 15)

如圖5A所示，與CON組比較，MOD組小鼠腦組織SOD活力明顯降低（P＜0.01），SCB（C）組小鼠腦組織SOD活力明顯增高（P＜0.05）；與MOD組比較，SCB（M）組小鼠腦組織SOD活力明顯增高（P＜0.05）。對各組小鼠腦組織M D A含量檢測結(jié)果如圖5 B所示，與CON比較，MOD組小鼠腦組織MDA含量明顯升高（P＜0.01），SCB（C）組小鼠腦組織MDA含量明顯降低（P＜0.05）；與MOD組比較，SCB（M）組小鼠腦組織MDA含量明顯降低（P＜0.05）。上述結(jié)果提示SCB可能通過提高小鼠腦組織的抗氧化能力而發(fā)揮抗腦衰老作用。

2.4 SCB對腦衰老小鼠腦組織中p19、p53、p21基因表達(dá)的影響

圖 6 SCB對小鼠腦組織p19、p53、p21 mRNA表達(dá)的影響（n＝3）Fig. 6 Effect of SCB on mRNA expression of p19, p53 and p21 genes in the brain tissues of mice (n = 3)

本研究應(yīng)用qPCR及Western blot方法分別從mRNA水平及蛋白水平觀察各組小鼠p19、p53、p21基因的表達(dá)情況。qPCR結(jié)果如圖6所示，與CON組比較，MOD組小鼠腦組織p19、p53、p21 mRNA表達(dá)量明顯增多（P＜0.05）；與MOD組相比，SCB（M）組p19、p53、p21 mRNA表達(dá)量明顯減少（P＜0.05）。SCB（C）與CON組相比未見統(tǒng)計學(xué)差異。上述結(jié)果提示SCB可能通過抑制p19、p53、p21 mRNA的表達(dá)而發(fā)揮改善記憶作用。

圖 7 SCB對小鼠腦組織p19、p53、p21蛋白表達(dá)的影響（n＝3）Fig. 7 Effect of SCB on protein expression of p19, p53 and p21 genes in the brain tissue of mice (n = 3)

Western blot結(jié)果如圖7所示，與CON組比較，MOD組小鼠腦組織p19、p53、p21蛋白表達(dá)水平均明顯增多（P＜0.01）；SCB（C）組小鼠p19（P＜0.05）、p21（P＜0.01）蛋白表達(dá)水平明顯減少，p53蛋白表達(dá)水平未見明顯差異；與MOD組相比，SCB（M）組p19、p53、p21蛋白表達(dá)水平明顯減少（P＜0.01）。進(jìn)一步驗證SCB有可能通過抑制p19、p53、p21表達(dá)而發(fā)揮相關(guān)作用。

3 討 論

人口的老齡化使抗衰老研究成為熱點(diǎn)。自由基損傷學(xué)說是眾多科學(xué)家共識的衰老學(xué)說[11-14]。隨著年齡的增長，體內(nèi)多種自由基逐漸在細(xì)胞組織中累積，最終導(dǎo)致衰老產(chǎn)生。皮下注射D-半乳糖是常用的構(gòu)建衰老模型的方法，此法通過自由基過量產(chǎn)生而引起衰老，與衰老學(xué)說的自由基理論相符合[15-17]。本研究前期結(jié)果顯示，五味子總木脂素能夠明顯改善D-半乳糖致衰小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，但其主要的活性成分尚不清楚。SCB是五味子木脂素中的單體化合物成分，已有文獻(xiàn)報道SCB具有較強(qiáng)的抗氧化能力[5-8]。因此，猜測五味子總木脂素的上述作用可能與SCB密切相關(guān)。前期對SCB的最佳劑量進(jìn)行了摸索，結(jié)果顯示20 mg/kg效果較好，因此，在本研究中將20 mg/kg SCB作為單一的給藥劑量給予D-半乳糖致衰小鼠。此外，本實驗設(shè)立了SCB（C）組，即將SCB應(yīng)用于健康小鼠，以觀察SCB對健康小鼠的影響。

SOD是機(jī)體最主要的抗氧化酶，它在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起著重要的作用，而MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，在腦組織中的含量隨著機(jī)體的逐漸衰老而不斷升高，是反映自由基導(dǎo)致的機(jī)體損傷程度的重要指標(biāo)[18-21]。本實驗結(jié)果顯示，SCB可以提高衰老小鼠腦組織SOD的活性，降低MDA含量，顯示較強(qiáng)的抗氧化作用；另外，與空白組相比，SCB（C）組小鼠腦組織SOD活力明顯增高，MDA含量明顯降低，提示SCB在衰老模型鼠及健康鼠都表現(xiàn)出明顯的抗氧化作用，該結(jié)果與其他研究SCB抗氧化功能的報道[6-8]是一致的。

氧化應(yīng)激引發(fā)細(xì)胞衰老的多種途徑涉及p53基因表達(dá)的改變。p53作為一種位于多種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的應(yīng)激蛋白，受到刺激便會大量堆積，進(jìn)而促進(jìn)凋亡因子Puma和Bax等的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體衰老[22-24]。p53水平主要取決于泛蛋白化和隨后的蛋白酶降解速率。主要針對p53的E3-type泛蛋白連接酶是MDM2，可以促進(jìn)p53被泛蛋白介導(dǎo)的蛋白酶體降解。p19ARF是p53的上游基因，p19ARF蛋白直接結(jié)合并抑制MDM2的活性，使其不能介導(dǎo)p53蛋白的降解，其表達(dá)水平升高是p53激活的原因之一[25-26]。p53的下游靶分子是p21，p21是Cyclin依賴的蛋白激酶的抑制因子，既可導(dǎo)致G1期停滯也可以導(dǎo)致G2期停滯，在細(xì)胞受到刺激后，p53表達(dá)水平迅速上調(diào)，激活p21基因，進(jìn)而抑制Cyclin A/E-CDK2的活性，阻止細(xì)胞周期的進(jìn)行[27-30]。可見，p19-p53-p21信號途徑在細(xì)胞衰老中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。本研究應(yīng)用qPCR及Western blot方法分別從mRNA水平及蛋白水平觀察各組小鼠p19、p53、p21的表達(dá)情況。結(jié)果顯示兩種方法得到的結(jié)果是一致的，即SCB能夠在mRNA及蛋白水平上下調(diào)D-半乳糖致衰小鼠p19、p53、p21基因的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮相關(guān)作用。

由于小鼠學(xué)習(xí)記憶能力容易受外界環(huán)境因素的影響，本實驗中選擇了兩種不同的行為學(xué)實驗方法（避暗實驗、Morris水迷宮實驗）進(jìn)行對比印證，以減少實驗結(jié)果的不穩(wěn)定性。實驗結(jié)果表明，無論在避暗實驗還是水迷宮實驗中，與MOD組比較，SCB均表現(xiàn)出良好的學(xué)習(xí)記憶能力；與CON組比較，SCB（C）組未見明顯差異。提示SCB能夠改善D-半乳糖所致的衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，而對健康小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響較小，這可能是由于健康鼠未出現(xiàn)D-半乳糖所致的學(xué)習(xí)記憶障礙，SCB的抗氧化作用而發(fā)揮的記憶改善作用不能充分體現(xiàn)。其具體機(jī)制將在后續(xù)的實驗中繼續(xù)研究。

綜上，本研究證實了SCB對D-半乳糖致腦衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力具有改善作用，該作用可能與其提高小鼠抗氧化能力以及降低小鼠腦組織中p19、p53、p21基因表達(dá)水平有關(guān)。本研究為開發(fā)具有輔助改善記憶功能的藥物及保健食品提供理論依據(jù)。