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        五味子乙素對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用

        2018-10-29 02:39:20孫偉靜高佳琪于澤鵬王春梅孫靖輝陳建光
        食品科學(xué) 2018年19期
        關(guān)鍵詞:半乳糖腦組織次數(shù)

        劉 聰,孫偉靜,李 寧,高佳琪,于澤鵬,敬 舒,王春梅,孫靖輝,陳建光,李 賀,*

        (1.北華大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室,吉林 吉林 132013;2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林 吉林 132013)

        隨著全球人口不斷老齡化,衰老人群日益增多。學(xué)習(xí)記憶能力減退與障礙是衰老人群的主要特征。研發(fā)具有輔助改善記憶功能的保健食品及藥物前景廣闊。本研究前期工作顯示,五味子總木脂素對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠具有顯著的改善記憶作用[1-2]。但該作用主要由哪些活性成分引起尚不清楚。五味子乙素(schisandrin B,SCB)是五味子木脂素中含量最高的聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)單體化合物,是五味子中主要活性成分之一[3-4]。已有研究報(bào)道SCB具有較強(qiáng)的抗氧化性[5-8],但目前鮮有SCB對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響的相關(guān)研究。因此,本研究通過(guò)D-半乳糖建立小鼠衰老模型,探討SCB的改善記憶作用及相關(guān)機(jī)制,為開(kāi)發(fā)輔助改善記憶功能的保健食品及藥物提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 動(dòng)物、材料與試劑

        清潔級(jí)健康ICR小白鼠,雄性,體質(zhì)量(20±2)g,由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(吉):2015-0005。小鼠采取分籠飼養(yǎng),且維持12 h∶12 h晝夜循環(huán),飼料供給充足,自由飲水。

        SCB 四川省維克奇生物科技有限公司;羧甲基纖維素鈉(分析純) 山東濰坊力特復(fù)合材料有限公司;二氧化鈦(分析純)、吐溫20(分析純) 天津永大試劑公司;D-半乳糖 美國(guó)S i g m a公司;HCl-Tris、30%丙烯酰胺、TEMED、過(guò)硫酸銨、Tris、甘氨酸 北京鼎國(guó)試劑公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、MDA試劑 南京建成生物工程研究所;脫脂奶粉 美國(guó)BD公司;p53蛋白、p21蛋白、p19蛋白 英國(guó)Abcam公司;ECL顯色液碧云天生物制品有限公司;RNA抽提試劑盒 美國(guó)Vazyme公司;SYBR Green Real-time 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)Super Mix 美國(guó)Invitrogen公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        infiniteM200全自動(dòng)酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司;Western blot電泳儀、電轉(zhuǎn)儀及實(shí)時(shí)熒光定量(quantitative real-time PCR,qPCR)儀 美國(guó)Bio-Rad公司;ChampChemi Professional+全自動(dòng)多色熒光及化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) 北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司;DT-200小鼠避暗儀、MT-200 Morris水迷宮分析儀 成都泰盟科技有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 動(dòng)物分組及給藥

        ICR小鼠隨機(jī)分為4 組,每組15 只。1)正常對(duì)照組(CON)組:每天灌胃蒸餾水及頸后皮下注射生理鹽水;2)衰老模型(MOD)組:每天灌胃蒸餾水及頸后皮下注射220 mg/kg D-半乳糖;3)SCB(M)組:每天灌胃20 mg/kg SCB,皮下注射220 mg/kg D-半乳糖;4)SCB(C)組:每天灌胃20 mg/kg SCB,皮下注射生理鹽水。

        1.3.2 小鼠避暗實(shí)驗(yàn)

        將小鼠放入避暗儀中,面部背向洞口放入明室,從小鼠進(jìn)入洞口至其到達(dá)暗室的時(shí)間即為潛伏期。本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠訓(xùn)練5 min,記錄在5 min內(nèi)小鼠的錯(cuò)誤次數(shù)。間隔24 h后進(jìn)行第二次實(shí)驗(yàn)。記錄每只鼠的潛伏期以及在5 min內(nèi)出現(xiàn)的錯(cuò)誤次數(shù)[9]。

        1.3.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

        將小鼠放在Morris水迷宮視頻跟蹤測(cè)試系統(tǒng)中,設(shè)置小鼠的訓(xùn)練時(shí)間設(shè)定為120 s,在120 s內(nèi)未達(dá)到終點(diǎn)的小鼠按120 s記錄。每隔24 h訓(xùn)練1 次,采集第5天的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。第一次實(shí)驗(yàn)之前將小鼠放在平臺(tái)附近,使其自動(dòng)爬上3 次。以后每次訓(xùn)練前將小鼠放在平臺(tái)附近,使其自主爬上到平臺(tái)一次。第6天把平臺(tái)去掉統(tǒng)計(jì)小鼠空間搜索能力。并記錄小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)和穿越有效區(qū)的次數(shù)[10]。

        1.3.4 SCB對(duì)衰老小鼠體內(nèi)SOD活力和MDA含量的影響

        從1.3.3節(jié)的各組中隨機(jī)選取10 只小鼠,在末次給藥后30 min后處死小鼠,取出腦組織及血清,應(yīng)用WST-1法檢測(cè)SOD活力,應(yīng)用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量。具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

        1.3.5 小鼠腦組織中p19、p53、p21基因表達(dá)的檢測(cè)

        1.3.4節(jié)中小鼠末次給藥后30 min,每組取3 只小鼠腦組織,應(yīng)用試劑盒提取細(xì)胞總RNA,按逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說(shuō)明操作合成cDNA。按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行qPCR擴(kuò)增,在GenBank里查找各基因序列號(hào),采用Primer 6.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),由北京鼎國(guó)昌盛生物工程公司合成,以β-actin為內(nèi)參基因,引物序列見(jiàn)表1。

        表 1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

        qPCR條件為95 ℃、10 min,1 個(gè)循環(huán);95 ℃、15 s,60 ℃、1 min,40 個(gè)循環(huán)。95 ℃、15 s,60 ℃、1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃、15 s,1 個(gè)循環(huán),制備溶解曲線(xiàn)。采用2-△△Ct進(jìn)行相對(duì)定量。

        1.3.6 Western blot法檢測(cè)腦組織中p19、p21及p53蛋白的表達(dá)情況1.3.4節(jié)中小鼠末次給藥后30 min,每組取3 只小鼠腦組織,加入裂解液,冰上裂解1 h,高速離心機(jī)離心取上清液。以二喹啉甲酸法測(cè)定組織蛋白濃度,以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳分離p19、p53、p21蛋白。2 h電轉(zhuǎn)移至聚丙二氟乙烯膜,取出膜在Tris緩沖液(TBS-T)中漂洗5 min,然后用封閉液封閉1 h(含5%脫脂奶粉的TBS-T)。室溫孵育后棄去封閉液,分別加入一抗p19(1∶1 000)、p53(1∶1 000)、p21(1∶1 000),4 ℃溫育過(guò)夜后,TBS-T洗5 次,每次5 min。加入二抗(1∶2 000)溫育2 h,TBS-T洗5 次,每次5 min,最后加入顯色液ECL顯色。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

        采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。避暗實(shí)驗(yàn)中的潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的穿越平臺(tái)、穿越有效區(qū)次數(shù)、在目標(biāo)象限停留時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù),小鼠腦組織中的SOD活力、MDA含量,qPCR和Western blot的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示,組間兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 避暗實(shí)驗(yàn)觀(guān)察SCB對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

        避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,第2天的記憶測(cè)試中(圖1A),與CON組相比,MOD組小鼠潛伏期明顯縮短(P<0.01),SCB(C)組小鼠未見(jiàn)明顯差異;與MOD組比較,SCB(M)組小鼠潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。如圖1B所示,與CON組相比,MOD組小鼠5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多(P<0.01),SCB(C)組小鼠未見(jiàn)明顯差異;與MOD組比較,SCB(M)組錯(cuò)誤次數(shù)減少(P<0.05)。以上結(jié)果提示SCB能夠提高D-半乳糖所致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

        圖 1 避暗實(shí)驗(yàn)觀(guān)察SCB對(duì)腦衰老小鼠潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)的影響(n= 15)Fig. 1 Effect of SCB on learning and memory in aging mice in dark avoidance test (n = 15)

        2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀(guān)察SCB對(duì)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

        2.2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        圖 2 定位航行實(shí)驗(yàn)中小鼠游泳潛伏期(n=15)Fig. 2 Swimming latency of mice in orientation navigation test (n = 15)

        定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2顯示,隨訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng),各組小鼠找到平臺(tái)時(shí)間逐漸縮短。與CON組比較,MOD組小鼠在訓(xùn)練第4天(P<0.05)及第5天(P<0.01)找到平臺(tái)時(shí)間明顯延長(zhǎng);SCB(C)組未見(jiàn)明顯差異。與MOD組比較,在訓(xùn)練第5天,SCB(M)組小鼠找到平臺(tái)潛伏期明顯縮短(P<0.05)。以上結(jié)果進(jìn)一步提示SCB能夠提高D-半乳糖所致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

        2.2.2 空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        如圖3、4所示,與CON組比較,MOD組小鼠在平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間明顯縮短(P<0.01),穿過(guò)原平臺(tái)的次數(shù)減少(P<0.05),SCB(C)組未見(jiàn)明顯差異。與MOD組相比,SCB(M)組在平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)SCB能夠提高D-半乳糖所致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

        圖 3 空間搜索實(shí)驗(yàn)中SCB對(duì)腦衰老小鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間及經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)的影響(n =15)Fig. 3 Effect of SCB on the time spent in target quadrant and the number of platform crossing in aging mice in spatial probe test (n = 15)

        圖 4 空間搜索實(shí)驗(yàn)中小鼠游泳軌跡圖(n=15)Fig. 4 Swimming trajectory of mice in spatial probe test (n = 15)

        2.3 SCB對(duì)腦衰老小鼠腦組織SOD活力、MDA含量的影響

        圖 5 SCB對(duì)腦衰老小鼠腦組織中SOD活力(A)及MDA含量(B)的影響(n=15)Fig. 5 Effect of SCB on SOD activity (A) and MDA content (B) in the brain tissue of aging mice (n = 15)

        如圖5A所示,與CON組比較,MOD組小鼠腦組織SOD活力明顯降低(P<0.01),SCB(C)組小鼠腦組織SOD活力明顯增高(P<0.05);與MOD組比較,SCB(M)組小鼠腦組織SOD活力明顯增高(P<0.05)。對(duì)各組小鼠腦組織M D A含量檢測(cè)結(jié)果如圖5 B所示,與CON比較,MOD組小鼠腦組織MDA含量明顯升高(P<0.01),SCB(C)組小鼠腦組織MDA含量明顯降低(P<0.05);與MOD組比較,SCB(M)組小鼠腦組織MDA含量明顯降低(P<0.05)。上述結(jié)果提示SCB可能通過(guò)提高小鼠腦組織的抗氧化能力而發(fā)揮抗腦衰老作用。

        2.4 SCB對(duì)腦衰老小鼠腦組織中p19、p53、p21基因表達(dá)的影響

        圖 6 SCB對(duì)小鼠腦組織p19、p53、p21 mRNA表達(dá)的影響(n=3)Fig. 6 Effect of SCB on mRNA expression of p19, p53 and p21 genes in the brain tissues of mice (n = 3)

        本研究應(yīng)用qPCR及Western blot方法分別從mRNA水平及蛋白水平觀(guān)察各組小鼠p19、p53、p21基因的表達(dá)情況。qPCR結(jié)果如圖6所示,與CON組比較,MOD組小鼠腦組織p19、p53、p21 mRNA表達(dá)量明顯增多(P<0.05);與MOD組相比,SCB(M)組p19、p53、p21 mRNA表達(dá)量明顯減少(P<0.05)。SCB(C)與CON組相比未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述結(jié)果提示SCB可能通過(guò)抑制p19、p53、p21 mRNA的表達(dá)而發(fā)揮改善記憶作用。

        圖 7 SCB對(duì)小鼠腦組織p19、p53、p21蛋白表達(dá)的影響(n=3)Fig. 7 Effect of SCB on protein expression of p19, p53 and p21 genes in the brain tissue of mice (n = 3)

        Western blot結(jié)果如圖7所示,與CON組比較,MOD組小鼠腦組織p19、p53、p21蛋白表達(dá)水平均明顯增多(P<0.01);SCB(C)組小鼠p19(P<0.05)、p21(P<0.01)蛋白表達(dá)水平明顯減少,p53蛋白表達(dá)水平未見(jiàn)明顯差異;與MOD組相比,SCB(M)組p19、p53、p21蛋白表達(dá)水平明顯減少(P<0.01)。進(jìn)一步驗(yàn)證SCB有可能通過(guò)抑制p19、p53、p21表達(dá)而發(fā)揮相關(guān)作用。

        3 討 論

        人口的老齡化使抗衰老研究成為熱點(diǎn)。自由基損傷學(xué)說(shuō)是眾多科學(xué)家共識(shí)的衰老學(xué)說(shuō)[11-14]。隨著年齡的增長(zhǎng),體內(nèi)多種自由基逐漸在細(xì)胞組織中累積,最終導(dǎo)致衰老產(chǎn)生。皮下注射D-半乳糖是常用的構(gòu)建衰老模型的方法,此法通過(guò)自由基過(guò)量產(chǎn)生而引起衰老,與衰老學(xué)說(shuō)的自由基理論相符合[15-17]。本研究前期結(jié)果顯示,五味子總木脂素能夠明顯改善D-半乳糖致衰小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,但其主要的活性成分尚不清楚。SCB是五味子木脂素中的單體化合物成分,已有文獻(xiàn)報(bào)道SCB具有較強(qiáng)的抗氧化能力[5-8]。因此,猜測(cè)五味子總木脂素的上述作用可能與SCB密切相關(guān)。前期對(duì)SCB的最佳劑量進(jìn)行了摸索,結(jié)果顯示20 mg/kg效果較好,因此,在本研究中將20 mg/kg SCB作為單一的給藥劑量給予D-半乳糖致衰小鼠。此外,本實(shí)驗(yàn)設(shè)立了SCB(C)組,即將SCB應(yīng)用于健康小鼠,以觀(guān)察SCB對(duì)健康小鼠的影響。

        SOD是機(jī)體最主要的抗氧化酶,它在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起著重要的作用,而MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物,在腦組織中的含量隨著機(jī)體的逐漸衰老而不斷升高,是反映自由基導(dǎo)致的機(jī)體損傷程度的重要指標(biāo)[18-21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SCB可以提高衰老小鼠腦組織SOD的活性,降低MDA含量,顯示較強(qiáng)的抗氧化作用;另外,與空白組相比,SCB(C)組小鼠腦組織SOD活力明顯增高,MDA含量明顯降低,提示SCB在衰老模型鼠及健康鼠都表現(xiàn)出明顯的抗氧化作用,該結(jié)果與其他研究SCB抗氧化功能的報(bào)道[6-8]是一致的。

        氧化應(yīng)激引發(fā)細(xì)胞衰老的多種途徑涉及p53基因表達(dá)的改變。p53作為一種位于多種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的應(yīng)激蛋白,受到刺激便會(huì)大量堆積,進(jìn)而促進(jìn)凋亡因子Puma和Bax等的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體衰老[22-24]。p53水平主要取決于泛蛋白化和隨后的蛋白酶降解速率。主要針對(duì)p53的E3-type泛蛋白連接酶是MDM2,可以促進(jìn)p53被泛蛋白介導(dǎo)的蛋白酶體降解。p19ARF是p53的上游基因,p19ARF蛋白直接結(jié)合并抑制MDM2的活性,使其不能介導(dǎo)p53蛋白的降解,其表達(dá)水平升高是p53激活的原因之一[25-26]。p53的下游靶分子是p21,p21是Cyclin依賴(lài)的蛋白激酶的抑制因子,既可導(dǎo)致G1期停滯也可以導(dǎo)致G2期停滯,在細(xì)胞受到刺激后,p53表達(dá)水平迅速上調(diào),激活p21基因,進(jìn)而抑制Cyclin A/E-CDK2的活性,阻止細(xì)胞周期的進(jìn)行[27-30]。可見(jiàn),p19-p53-p21信號(hào)途徑在細(xì)胞衰老中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。本研究應(yīng)用qPCR及Western blot方法分別從mRNA水平及蛋白水平觀(guān)察各組小鼠p19、p53、p21的表達(dá)情況。結(jié)果顯示兩種方法得到的結(jié)果是一致的,即SCB能夠在mRNA及蛋白水平上下調(diào)D-半乳糖致衰小鼠p19、p53、p21基因的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮相關(guān)作用。

        由于小鼠學(xué)習(xí)記憶能力容易受外界環(huán)境因素的影響,本實(shí)驗(yàn)中選擇了兩種不同的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法(避暗實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn))進(jìn)行對(duì)比印證,以減少實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,無(wú)論在避暗實(shí)驗(yàn)還是水迷宮實(shí)驗(yàn)中,與MOD組比較,SCB均表現(xiàn)出良好的學(xué)習(xí)記憶能力;與CON組比較,SCB(C)組未見(jiàn)明顯差異。提示SCB能夠改善D-半乳糖所致的衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,而對(duì)健康小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響較小,這可能是由于健康鼠未出現(xiàn)D-半乳糖所致的學(xué)習(xí)記憶障礙,SCB的抗氧化作用而發(fā)揮的記憶改善作用不能充分體現(xiàn)。其具體機(jī)制將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)研究。

        綜上,本研究證實(shí)了SCB對(duì)D-半乳糖致腦衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力具有改善作用,該作用可能與其提高小鼠抗氧化能力以及降低小鼠腦組織中p19、p53、p21基因表達(dá)水平有關(guān)。本研究為開(kāi)發(fā)具有輔助改善記憶功能的藥物及保健食品提供理論依據(jù)。

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