周新麗，申炳陽，張三強(qiáng)

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

真空冷凍干燥過程可以概括為3 個(gè)主要步驟：物料中的水分被凍結(jié)，冰在一次干燥過程中升華，非冷凍水在二次干燥過程中解吸[1-4]。雖然冷凍在整個(gè)冷凍干燥過程中經(jīng)歷時(shí)間很短，但其決定了形成冰的形態(tài)、大小、分布，對后期的升華、解吸速率以及凍干產(chǎn)品的質(zhì)量（品相、孔隙率、蛋白質(zhì)聚集等）影響很大。小的冰晶不利于冰的升華干燥，但冰晶越小，干燥后物料質(zhì)構(gòu)變化越小[5-10]。

雖然冷凍干燥中冷凍的重要性已經(jīng)受到重視，但水轉(zhuǎn)化成冰這一關(guān)鍵點(diǎn)不能直接控制，成核是隨機(jī)自發(fā)的過程，形成的冰晶大小具有隨機(jī)分布的特點(diǎn)。近些年一些研究證明，功率超聲波在溶液中傳播時(shí)，引起的多種物理、化學(xué)效應(yīng)會對冰結(jié)晶產(chǎn)生影響，其中空化效應(yīng)對冰結(jié)晶的影響比較顯著，一方面有利于冰結(jié)晶過程中晶核的生成；另一方面能夠促進(jìn)凍結(jié)過程中的傳熱、傳質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)冰晶體的生長[11-14]?；诖嘶驹?，功率超聲技術(shù)在食品冷凍各方面的應(yīng)用已經(jīng)被報(bào)道，包括初始成核、控制冰晶體的尺寸、加快凍結(jié)速率以及改善冷凍食品的品質(zhì)[15-16]。Kiani等[17]發(fā)現(xiàn)，超聲波能在不同的溫度（-5.4～-1.2 ℃）下觸發(fā)冰晶成核，并在不同的超聲波觸發(fā)溫度下，冰晶成核溫度都具有高度的可重復(fù)性，超聲波觸發(fā)溫度與成核溫度之間呈線性關(guān)系（R2＝0.96）。Nakagawa等[18]發(fā)現(xiàn)，超聲波在較高溫度下觸發(fā)溶液成核可以獲得較大的冰晶，利用此性質(zhì)提高了冷凍干燥的干燥速率。Hu Fen[19]、Jabbari-Hichri[20]等研究超聲輔助凍結(jié)含氣溶液時(shí)發(fā)現(xiàn)，氣體含量對超聲波控制成核形成的冰晶大小分布有明顯影響，液體中充入氣泡是提高超聲輻照啟動成核的一種可行方法。Jabbari-Hichri等[20]在研究一系列不同含氣量的甘露醇溶液經(jīng)超聲波控制成核時(shí)，發(fā)現(xiàn)在相同的超聲強(qiáng)度下形成的冰晶大小分布和冰晶的平均大小均有顯著差異，含氣量高的溶液獲得的冰晶較為均勻。王成會等[21]在研究空化對液體傳聲特性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，液體內(nèi)預(yù)先存在的氣泡會對聲衰減系數(shù)和聲速產(chǎn)生的影響很大。

本研究主要以1 mg/mL過氧化氫酶（catalase，CAT）作為模式蛋白，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的蔗糖溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的甘露醇溶液（分別作為冷凍保護(hù)劑和賦形劑），將5 種溶氧水平CAT溶液經(jīng)超聲波控制成核并冷凍干燥，分析水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、孔隙率以及酶活力回收率，探討充氣法對提高超聲波控制成核輔助冷凍干燥的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CAT（牛肝） 美國Sigma公司；超純水 實(shí)驗(yàn)室自制；蔗糖、甘露醇、過氧化氫（30%）、磷酸鹽緩沖液 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

THD-2010A超聲波發(fā)生器 深圳市太和達(dá)科技有限公司；2.0 EL型冷凍干燥機(jī) 美國Virtis公司；XT H 225 LC型工業(yè)X射線計(jì)算機(jī)斷層掃描系統(tǒng)（X-ray computed tomography，X-CT） 日本尼康公司；722S型紫外-可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；LyoResis共晶點(diǎn)測試儀 北京海博飛科技有限公司；34970A型數(shù)據(jù)采集儀 美國Agilent公司；AZ-8402型便攜式溶氧儀 臺灣衡欣科技股份有限公司；BT125D型電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；西林瓶（7 mL） 寧波正力藥品包裝有限公司；溶液過濾器（0.22 μm） 天津亳津科技有限公司。

圖 1 超聲輔助凍結(jié)裝置Fig. 1 of the ultrasonic assisted freezing device

超聲波輔助凍結(jié)裝置如圖1所示，由超聲波發(fā)生器（29 kHz）、2 個(gè)超聲振子（60 W）、不銹鋼平板（200 mm×200 mm×1.5 mm）組成。首先用鋁箔法確定超聲波系統(tǒng)中空化作用強(qiáng)烈的區(qū)域，然后在此區(qū)域增加緊固西林瓶的擋板，實(shí)驗(yàn)時(shí)將西林瓶置于兩個(gè)擋板中間（為了防止西林瓶在超聲振動時(shí)滑動、跳起）；溫度檢測系統(tǒng)由T型熱電偶、數(shù)據(jù)采集儀和計(jì)算機(jī)組成。實(shí)驗(yàn)時(shí)將超聲波輔助凍結(jié)系統(tǒng)直接置于凍干機(jī)擱板上固定位置處。

1.3 方法

1.3.1 溶液制備

選取CAT作為模式蛋白，配制1 mg/mL的CAT溶液于磷酸鹽緩沖液（pH 7.2～7.4）中，依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的蔗糖溶液（冷凍保護(hù)劑）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的甘露醇溶液（賦形劑）。CAT溶液配制好后用0.22 μm孔徑的過濾器過濾，用移液槍吸取3 mL CAT溶液移入西林瓶中。5 種溶氧水平的溶液通過以下方法獲取。

低溶氧水平：溶氧量為4.10 mg/L。將配制好的CAT溶液置于凍干機(jī)真空室中，控制真空室壓力為10 kPa，擱板溫度設(shè)置為4 ℃（防止酶過度失活），進(jìn)行真空脫氣8 h。

較低溶氧水平：溶氧量為6.36 mg/L。將配制好的CAT溶液置于凍干機(jī)真空室中，控制真空室壓力為10 kPa，擱板溫度設(shè)置為4 ℃，進(jìn)行真空脫氣4 h。

平衡溶氧水平：溶氧量為8.45 mg/L。將配制好的CAT溶液直接密封后放入4 ℃冰箱中降溫待用。

較高溶氧水平：溶氧量為10.24 mg/L。將配制好的CAT溶液直接密封后放入4 ℃冰箱中降溫至4 ℃后，實(shí)驗(yàn)前直接注入壓縮空氣，使溶氧量達(dá)到10.24 mg/L時(shí)停止注入。

高溶氧水平：溶氧量為13.44 mg/L。將配制好的CAT溶液直接注入壓縮空氣，使溶氧量達(dá)到13.44 mg/L時(shí)停止注入，用液氮快速冷卻但不要凍結(jié)。

1.3.2 CAT溶液共晶點(diǎn)與共熔點(diǎn)的測定

取20 mL CAT溶液于燒杯中，把燒杯放置在凍干機(jī)擱板上，將共晶點(diǎn)測試儀的電極和熱電偶插入溶液中心位置處，開啟凍干機(jī)壓縮機(jī)降溫至-50 ℃，記錄數(shù)據(jù)；當(dāng)CAT溶液降溫至-50 ℃時(shí)，設(shè)置凍干機(jī)擱板溫度為0 ℃并開始升溫。根據(jù)共晶點(diǎn)測試儀記錄的溫度曲線和電阻曲線讀取CAT溶液的共晶點(diǎn)為-31.5～-25.5 ℃，共熔點(diǎn)為-27.5～-22.7 ℃；一般預(yù)凍溫度低于共晶點(diǎn)溫度5～10 ℃，因此預(yù)凍溫度選擇為-40 ℃，一次干燥溫度略低于共熔點(diǎn)溫度，因此選擇一次干燥溫度為-30 ℃。

1.3.3 CAT溶液成核溫度的確定

將超聲波平板放置于凍干機(jī)擱板上，開啟凍干機(jī)，控制凍干機(jī)冷腔和超聲平板溫度至4 ℃后，用移液槍將控制好溶氧量的CAT溶液移取3 mL至西林瓶中，把西林瓶放置于兩個(gè)擋板中間，熱電偶插入溶液幾何中心位置處。關(guān)閉冷腔艙門，設(shè)置擱板溫度為-40 ℃，讓凍干機(jī)擱板與超聲波平板從4 ℃開始降溫。開啟溫度采集系統(tǒng)，數(shù)據(jù)采集儀每隔1 s采集一次溫度。當(dāng)CAT溶液溫度降至-1 ℃時(shí)，開啟超聲功率為0.26 W/cm2的超聲波5 s；若未見成核現(xiàn)象，溫度每降低1 ℃施加5 s超聲波，直至CAT溶液成核，根據(jù)凍結(jié)曲線尋找各個(gè)溶氧量下CAT溶液的最大超聲波觸發(fā)成核溫度。另取平衡溶氧水平的CAT溶液（8.45 mg/L）進(jìn)行自發(fā)成核并冷凍干燥為對照實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 超聲波輔助冷凍干燥

對不同溶氧水平的CAT溶液按照上述確定的最大超聲波觸發(fā)成核溫度進(jìn)行控制成核，超聲波觸發(fā)成核后取出熱電偶，溶液繼續(xù)冷凍至-40 ℃，取出超聲波平板，讓溶液在-40 ℃的凍干機(jī)擱板上低溫保持2 h。設(shè)置擱板溫度-30 ℃、壓力10 Pa，每隔2 h取出稱質(zhì)量。當(dāng)凍干溶液的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至10%以下時(shí)轉(zhuǎn)為二次干燥，設(shè)置擱板溫度10 ℃，壓力10 Pa。每隔2 h取出稱質(zhì)量，當(dāng)凍干溶液水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至5%以下時(shí)，干燥結(jié)束。干燥結(jié)束后進(jìn)行真空包裝，待用。根據(jù)每隔2 h稱的樣品質(zhì)量，計(jì)算其水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并繪制水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)曲線，升華干燥階段的時(shí)間可由水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)曲線讀取。

1.3.5 孔隙率的測定

凍干樣品中孔隙的形態(tài)可以看作是樣品在之前冷凍過程中所形成的冰晶的形態(tài)，是一種研究結(jié)晶過程較為常用的方法[22-24]。首先將潔凈的西林瓶置于X-CT載物臺上，調(diào)整西林瓶位置后校正灰度；將帶瓶凍干餅放入工業(yè)X-CT機(jī)進(jìn)行掃描。X射線掃描電壓為72 kV，掃描電流為140 μA。曝光時(shí)間為500 ms、拍攝張數(shù)為1 800 張，即掃描結(jié)束將有1 800 張二維平面（2D）掃描圖；利用3CT Pro 3D軟件合成三維立體（3D）圖形，將2D掃描圖重構(gòu)組成3D圖像模型；利用VGStudio MAX 2.2分析軟件對3D圖像模型進(jìn)行分析；在模型中選取出一個(gè)直徑5 mm、高度5 mm的圓柱體，定義為一個(gè)研究區(qū)域（region of interest，ROI）；將ROI放大，直至可以區(qū)分凍干餅固體與空氣的邊界，定義孔隙的邊界；通過VGStudio MAX 2.2分析軟件，統(tǒng)計(jì)計(jì)算得出一個(gè)ROI的孔隙率；凍干餅的孔隙率由3個(gè)ROI的孔隙率的平均值求得。

1.3.6 酶活力回收率的測定

CAT活力的測定方法以Beers and Sizers法[25]為基礎(chǔ)進(jìn)行一定改進(jìn)。首先在每組含凍干樣品的西林瓶中加入3 mL過濾后的純水復(fù)水，然后將此復(fù)水后的CAT溶液放入25℃水浴鍋中恒溫待用。以pH 7.2～7.4的磷酸鹽緩沖液為空白對照，在3 mL比色皿中加入2.9 mL、體積分?jǐn)?shù)2%過氧化氫，再取復(fù)水后的CAT溶液0.1 mL加入其中，記錄240 nm波長處吸光度從0.45到0.40的時(shí)間（T），同時(shí)測定冷凍干燥前的CAT溶液吸光度從0.45到0.40的時(shí)間（T0）。各溶氧水平的CAT溶液凍干前后都要分別測定。酶活力回收率計(jì)算方式如下。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 9.0軟件對數(shù)據(jù)作圖，并用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行配對樣本t檢驗(yàn)，分析不同組間的差異性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶氧量下超聲波控制CAT溶液成核對升華干燥速率的影響

表 1 不同溶氧量CAT溶液的超聲波控制成核參數(shù)和成核后的升華干燥時(shí)間Table 1 Ultrasonic control nucleation parameters of CAT solutions with different dissolved oxygen contents and sublimation drying time after nucleation

由表1可知，溶氧量越高，最大超聲波觸發(fā)成核溫度越高。平衡溶氧水平的CAT溶液（8.45 mg/L）在超聲波控制成核后的升華干燥時(shí)間是26.81 h，比對照組縮短了21.05%；而溶氧量高的CAT溶液（10.24、13.44 mg/L）在超聲波控制成核后的升華冷凍干燥時(shí)間分別比對照組縮短了32.98%、41.63%；溶氧量低的CAT溶液（4.10、6.36 mg/L）在超聲波控制成核后的升華干燥時(shí)間分別縮短了9.36%、12.98%。這說明了在4.10～13.44 mg/L溶氧范圍內(nèi)，超聲波控制成核后CAT溶液的冰晶尺寸增大，因而都能加快溶液的冷凍干燥速率，且提高溶液中溶氧量可以大幅度縮短升華干燥時(shí)間。

2.2 不同溶氧量下超聲波控制CAT溶液成核對升華干燥過程中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖 2 不同溶氧量下超聲波控制CAT溶液成核在升華干燥過程中的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig. 2 Water contents of CAT solution with different dissolved oxygen contents during ultrasonic controlled nucleation and sublimation drying process

由圖2可以看出，經(jīng)超聲波控制成核后，各溶氧量CAT溶液的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)曲線明顯都在對照組的下方，由于對照組形成的冰晶較小，升華后干燥層阻力較大；因此相較于經(jīng)超聲波控制成核后的各溶氧量CAT溶液，其升華干燥后期階段的干燥速率較小，干燥時(shí)間較長。此外，經(jīng)過相同干燥時(shí)間，CAT溶液的溶氧量越高，其水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)越低，干燥速率越大。溶氧量為10.24、13.44 mg/L的CAT溶液，在升華干燥階段的前2 h內(nèi)，它們的干燥速率與對照組并未出現(xiàn)顯著差異，隨著干燥時(shí)間的延長，其干燥速率顯著大于對照組。溶氧量為4.10、6.36、8.45 mg/L的CAT溶液，在干燥階段的前4 h內(nèi)，它們的干燥速率與對照組沒有顯著差異；而溶氧量為4.10 mg/L的CAT溶液，它的干燥速率與對照組在前12 h內(nèi)沒有顯著差異，隨著干燥時(shí)間的延長，其干燥速率顯著大于對照組?？偟貋碚f，在4.10～13.44 mg/L的溶氧范圍內(nèi)，溶氧量越高，干燥速率越大。

2.3 不同溶氧量下超聲波控制CAT溶液成核對升華干燥后孔隙率的影響

溶液凍結(jié)過程中水固化成冰，冰晶升華后留下孔隙，研究孔隙的大小和分布可以反映凍結(jié)過程中冰晶固化的規(guī)律，同時(shí)孔隙大小和分布可以直接影響多孔物料中的傳質(zhì)過程，從而影響干燥速率[26]。由圖3可知，隨著CAT溶液中溶氧量的增加，凍干后的孔隙率逐漸增大，但這種規(guī)律并不呈線性關(guān)系，溶氧量從4.10 mg/L增加到6.36 mg/L時(shí)孔隙率增加不明顯，而溶氧量從8.45 mg/L增加到13.44 mg/L時(shí)孔隙率顯著增加。張三強(qiáng)等[27]在研究中發(fā)現(xiàn)，溶液中的初始溶氧量會對超聲波控制成核形成的冰晶產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響隨后的凍干過程。4.10、6.36 mg/L這兩種溶氧量CAT溶液的孔隙率略大于對照組，經(jīng)過顯著性分析，它們的孔隙率與對照組無顯著差異。8.45、10.24、13.44 mg/L這3 種溶氧量的CAT溶液在凍干后的孔隙率明顯大于對照組，它們的孔隙率分別提高了28.53%、64.18%、80.11%；這是因?yàn)槌暡ㄔ谳^高成核溫度下觸發(fā)形成的晶核能夠生長成較大的冰晶，冰晶升華后可以形成較大的孔隙，因此凍干后形成的孔隙率也較大。而充氣后CAT溶液（溶氧量為10.24、13.44 mg/L）的孔隙率要遠(yuǎn)大于平衡溶氧水平CAT溶液（溶氧量為8.45 mg/L）的孔隙率，說明了充氣可以大幅提高孔隙率，進(jìn)而提高干燥速率。

圖 3 不同溶氧量CAT溶液經(jīng)超聲波控制成核升華干燥后的孔隙率Fig. 3 Porosity of CAT solution with different dissolved oxygen contents during ultrasonic controlled nucleation and sublimation drying process

2.4 不同溶氧量下超聲波控制CAT溶液成核對升華干燥后酶活力回收率的影響

圖 4 不同溶氧量CAT溶液經(jīng)超聲波控制成核升華干燥后的酶活力回收率Fig. 4 Enzyme activity recovery of CAT solution with different dissolved oxygen contents after ultrasonic controlled nucleation and sublimation drying

由圖4可知，4.10、6.36、8.45、10.24 mg/L這4 種溶氧量的CAT溶液經(jīng)超聲波控制成核升華干燥后的酶活力回收率都高于95%，與對照組相比酶活力沒有損失。而溶氧量為13.44 mg/L的CAT溶液經(jīng)超聲波控制成核升華干燥后的酶活力回收率僅為83.3%，這可能一方面是因?yàn)樵撊苎趿肯翪AT溶液的最大超聲波觸發(fā)成核溫度高（（-1.29±0.11）℃），溶液凍結(jié)過程中相變時(shí)間長，溶質(zhì)存在濃縮現(xiàn)象損傷了酶活力；另一方面在較高溫度下功率超聲波的空化效應(yīng)比較劇烈，產(chǎn)生的瞬時(shí)高溫（＞5 000 K）、高壓（100 MPa）和高能沖擊波（約108N/m2）[28-29]都會對CAT的蛋白分子構(gòu)象產(chǎn)生不利影響，進(jìn)而造成酶活力的損失。溶氧量為4.10、6.36 mg/L的CAT溶液經(jīng)超聲波控制成核升華干燥后的酶活力回收率要顯著高于對照組，這可能是因?yàn)槊摎夂笕芤褐械娜苎趿考皻馀轀p少，空氣在溶液凍結(jié)和升華干燥過程中對酶活力造成的損失降低了，而且超聲作用對酶活力有激發(fā)的效果[30]。

3 結(jié) 論

本研究對不同溶氧量的CAT溶液進(jìn)行超聲波控制成核并冷凍干燥，考察溶液充氣法用于超聲波控制成核在升華干燥速率、孔隙率、酶活力回收率方面的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在4.10～13.44 mg/L的溶氧范圍內(nèi)對CAT溶液采用超聲波控制成核，隨著溶液中溶氧量的增加，最大超聲波觸發(fā)成核溫度提高，凍結(jié)后形成的冰晶尺寸增大，冷凍干燥速率加快，但溶氧量過高會降低酶活力回收率。綜上所述，超聲波控制成核輔助凍干時(shí)，在一定范圍內(nèi)能提高溶液含氣量，不僅可以縮短升華干燥時(shí)間，降低真空冷凍干燥的能耗，而且對凍干物品的質(zhì)量沒有顯著影響；顯示了充氣法用于功率超聲波控制成核對冷凍干燥技術(shù)的積極意義。