劉 梅，鄧 杰，謝 軍，李 覓，吳樹坤，黃治國(guó),*

（1.四川理工學(xué)院 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川 溫江 611130）

中國(guó)白酒是我國(guó)特有的一種蒸餾酒，承載了中國(guó)悠久的歷史與文化，為世界六大蒸餾酒之一。中國(guó)白酒具有酒體透明、清澈純凈、口感協(xié)調(diào)、芳香四溢、入口爽凈、飲后回味悠久等特點(diǎn)[1]。隨著白酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，窖泥作為企業(yè)的商品或者固定資產(chǎn)參與社會(huì)的各種經(jīng)濟(jì)活動(dòng)，窖泥品質(zhì)的評(píng)價(jià)也越來越重要，因此需要建立科學(xué)、客觀的窖泥評(píng)定方法。目前窖泥品質(zhì)的評(píng)價(jià)依舊以感官評(píng)價(jià)為主，帶有一定的主觀性。與糟醅不同，窖泥是一個(gè)空間位置相對(duì)固定的微生物的主要棲息地。通過對(duì)窖泥進(jìn)行全面地研究有助于解釋復(fù)雜的白酒釀造機(jī)理，從而進(jìn)一步提高白酒品質(zhì)。目前，并沒有一套較為完整、精確的理化指標(biāo)來對(duì)窖泥品質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)判，又由于窖泥是釀酒微生物的容器，是釀造微生物的來源，窖泥品質(zhì)與窖泥微生物具有一定的規(guī)律性[2]，所以窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)能較好地反映窖泥品質(zhì)。窖泥中細(xì)菌和古菌群落結(jié)構(gòu)與腐殖酸、有效磷含量呈正相關(guān)，與總酸含量呈負(fù)相關(guān)[3]；細(xì)菌和古菌多樣性與總酸含量總體呈極顯著的負(fù)相關(guān)，與總氮含量呈極顯著的正相關(guān)；腐殖酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與細(xì)菌多樣性也有顯著的正相關(guān)關(guān)系[4]，可見窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)特征與部分理化指標(biāo)存在一定的相關(guān)性。因此，本研究通過測(cè)定理化指標(biāo)與窖泥微生物群落的相關(guān)性，了解窖泥中哪些微生物對(duì)窖泥品質(zhì)的影響較大，并得出與其相關(guān)性較高，即能更好反映窖泥品質(zhì)的理化指標(biāo)，與感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)相結(jié)合，對(duì)窖泥品質(zhì)進(jìn)行更準(zhǔn)確、更低成本的評(píng)定。理化指標(biāo)和微生物群落反映出的信息對(duì)窖泥維護(hù)、人工窖泥的研制有重要意義，可進(jìn)一步指導(dǎo)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根據(jù)表1窖泥感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，有針對(duì)性地采集不同品質(zhì)窖泥。窖泥樣品均來自四川地區(qū)某白酒廠生產(chǎn)窖池，且窖池連續(xù)生產(chǎn)使用5 年以上，取樣部位為每口窖池窖底中心部位（窖泥樣品編號(hào)為一級(jí)：1、2、3號(hào)；二級(jí)：4、5、6號(hào)；三級(jí)：7、8、9號(hào)），所取樣品用塑封袋密封后迅速置于低溫取樣盒中，冷藏運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

表 1 窖泥樣品感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of pit mud samples

無水乙醇、碘化汞、碘化鉀、氫氧化鈉、酒石酸鈉鉀、氯化銨、鉬酸銨、氟化銨、氯化亞錫、磷酸二氫鉀、焦磷酸鈉、腐殖酸鈉、硫酸鉀、硫酸銅（分析純） 成都科龍化工試劑廠；甲基紅、溴甲酚綠（分析純） 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；硝酸、氟化氫、鹽酸、濃硫酸、硼酸（分析純） 重慶川東化工集團(tuán)；土壤DNA提取試劑盒 美國(guó)MOBIO公司；QIAquick Gel Extraction膠回收試劑盒 中國(guó)康為世紀(jì)生物科技有限公司；Quant-iT PicoGreen定量試劑盒 美國(guó)Invitrogen公司；EX taq酶、dNTPs、DNA Marker 日本Takara公司；正、反向引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；高通量測(cè)序試劑 美國(guó)Roche公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Kjeltec 8400全自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司；HD-4水分活度測(cè)定儀 無錫市華科儀表有限公司；Starter2100 pH計(jì) 奧豪斯儀器有限公司；Optima8000電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀、LS55熒光分光光度計(jì) 美國(guó)Perkin Elmer公司；UNIVERSAL 32R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Hettich公司；Minisubcell電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Bio-Best 200E凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)SIM公司；SCILOGEX MX-S型可調(diào)均質(zhì)機(jī) 美國(guó)賽洛捷克公司；GS junior高通量測(cè)序儀 美國(guó)Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標(biāo)測(cè)定

參考文獻(xiàn)[5]中方法，采用烘干法測(cè)定窖泥中的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，納氏試劑比色法測(cè)定氨態(tài)氮含量，油浴法測(cè)定腐殖酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，酸性氯化銨浸提-酸性鉬酸銨和氯化亞錫溶液比色法測(cè)定有效磷含量。采用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定窖泥樣品總氮含量[4]；用pH計(jì)測(cè)定窖泥樣品pH值[3]；利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀檢測(cè)窖泥中的鐵、鈣元素含量[6]。

1.3.2 窖泥總DNA提取、PCR擴(kuò)增及定量測(cè)定

采用PowerSoil DNA Isolation Kit提取窖泥微生物總DNA，DNA樣品于-20 ℃保存。對(duì)提取后的各樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物取5 μL用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）中反向引物為1401RMID1。程序?yàn)椋?4 ℃維持3 min；30 個(gè)循環(huán)：94 ℃維持15 s，56 ℃維持30 s，72 ℃維持90 s；72 ℃維持10 min；4 ℃保溫。采用QIAquick Gel Extraction膠回收試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增目的產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，使用Quant-iT PicoGreen定量試劑盒對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量測(cè)定。

1.3.3 高通量測(cè)序

目前，泉州市政府已經(jīng)查明事件真相，并已經(jīng)對(duì)責(zé)任人做出處理。但是，回顧整個(gè)事件的處置過程，確有很多值得深思之處。

將經(jīng)過定量測(cè)定的DNA文庫(kù)樣本進(jìn)行擴(kuò)增子質(zhì)量濃度計(jì)算，設(shè)計(jì)emPCR體系[7]，emPCR程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 4.5 min，68 ℃ 30 s，50 個(gè)循環(huán)；10 ℃保存，擴(kuò)增完成后檢測(cè)emPCR擴(kuò)增結(jié)果。按上機(jī)要求稀釋擴(kuò)增子，確定上樣量，進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過Mothur軟件處理測(cè)序數(shù)據(jù)[8]，對(duì)窖泥樣品中細(xì)菌進(jìn)行操作分類單位（operational taxonomic unit，OTU）分類，進(jìn)行進(jìn)一步分析處理，獲得微生物不同的分類。理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表示為±s，采用SPSS 20軟件對(duì)理化指標(biāo)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行降維后的因子分析；將窖泥微生物群落分析數(shù)據(jù)與理化指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，研究窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)與各理化指標(biāo)的關(guān)系，以P＜0.05表示相關(guān)性顯著；對(duì)數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法進(jìn)行方差分析，觀測(cè)樣本群落結(jié)構(gòu)[9]，在Excel軟件中編輯作圖；將窖泥樣品中和細(xì)菌群落相關(guān)性達(dá)到顯著或者極顯著水平的理化指標(biāo)，及理化指標(biāo)主成分分析所得的綜合理化指標(biāo)的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，使用Ward方法對(duì)窖泥的各指標(biāo)進(jìn)行聚類分析[10]，驗(yàn)證結(jié)論的可靠性。利用R軟件[11-13]對(duì)細(xì)菌群落和理化指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行進(jìn)一步的印證。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同等級(jí)窖泥理化指標(biāo)的差異分析

圖 1 不同等級(jí)窖泥的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig. 1 Water content in pit mud

由圖1可見，一級(jí)窖泥的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值略高于二級(jí)、三級(jí)窖泥，但不同等級(jí)窖泥的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不顯著（P＞0.05）。

圖 2 不同等級(jí)窖泥的總氮含量Fig. 2 Total nitrogen content in pit mud

由圖2可見，在樣品范圍內(nèi)，窖泥總氮含量平均值隨窖泥品質(zhì)的提高而呈上升趨勢(shì)，一級(jí)窖泥總氮含量顯著高于三級(jí)窖泥（P＜0.05），但與二級(jí)窖泥差異不顯著（P＞0.05）。

圖 3 不同等級(jí)窖泥的氨態(tài)氮含量Fig. 3 Ammonium nitrogen content in pit mud

由圖3可見，作為總氮的主要組成部分，窖泥氨態(tài)氮含量與不同等級(jí)窖泥總氮含量呈現(xiàn)出類似規(guī)律，不同等級(jí)窖泥中氨態(tài)氮含量平均值差異顯著（P＜0.05），即氨態(tài)氮含量隨窖泥品質(zhì)的提高而上升。

圖 4 不同等級(jí)窖泥的有效磷含量Fig. 4 Available phosphorus content in pit mud

圖 5 不同等級(jí)窖泥的窖泥腐殖酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig. 5 Humic acid conten in pit mud

圖 6 不同等級(jí)窖泥鈣、鐵元素含量Fig. 6 Calcium and iron contents in pit mud

由圖4～6可見，在樣品范圍內(nèi)，不同等級(jí)窖泥中有效磷含量、腐殖酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、鈣和鐵元素含量平均值差異都不顯著（P＞0.05）。磷元素是微生物重要組成成分，窖泥中的微生物在死亡分解后，細(xì)胞中的磷元素會(huì)增加窖泥中有效磷的含量[14]。因此，有效磷含量只能說明窖齡的長(zhǎng)短，但并不能說明窖泥質(zhì)量的好壞。腐殖酸能為窖泥內(nèi)部部分微生物提供有益的生存環(huán)境，是窖泥豐富微生物組成的一種特殊培養(yǎng)基，可起到緩沖作用和離子交換作用，同時(shí)具有良好的保水作用[15]，能夠緩解乳酸鈣、乳酸鐵的形成，避免窖泥板結(jié)退化[16]。因此腐殖酸雖需要達(dá)到一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但其與窖泥品質(zhì)的變化并不存在規(guī)律性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明有效磷含量、腐殖酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、鈣和鐵元素含量并不能體現(xiàn)窖泥品質(zhì)的優(yōu)劣。

由圖7可見，不同等級(jí)窖泥的pH值平均值差異顯著（P＜0.05），窖泥質(zhì)量越好，其pH值更接近于7。白酒的發(fā)酵過程中微生物的代謝會(huì)產(chǎn)生一定量的有機(jī)酸，品質(zhì)較好的窖泥pH值接近于中性有兩種可能，一是窖泥有一定的酸緩沖能力，二是窖池內(nèi)部發(fā)生的某些反應(yīng)轉(zhuǎn)化有機(jī)酸的能力較強(qiáng)。窖泥pH值能反映窖池發(fā)酵是否正常，影響著釀酒微生物自身的繁殖及其參與的生化反應(yīng)。

圖 7 不同等級(jí)窖泥的pH值Fig. 7 pH of pit mud

2.2 不同等級(jí)窖泥樣品中細(xì)菌OTU分類的差異分析

圖 8 窖泥樣品OUT分布Fig. 8 OUT distribution of pit mud samples

由圖8可見，通過Mothur軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，在基于3%的非相似度條件下，一共分成了2 050 個(gè)OTU分類，其中一級(jí)窖泥獲得的OTU數(shù)占總OTU數(shù)的50.6%，超過了二級(jí)、三級(jí)窖泥OTU數(shù)的總和，其中二級(jí)窖泥的OTU數(shù)占總OTU數(shù)的27.4%，三級(jí)窖泥的OTU數(shù)占總OTU數(shù)的22.0%。不難發(fā)現(xiàn)，雖然不同等級(jí)窖泥之間的OUT數(shù)目差異不顯著（P＞0.05），但總體上窖泥中細(xì)菌OTU數(shù)隨著窖泥品質(zhì)的提升而呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。

2.3 不同等級(jí)窖泥中細(xì)菌的分類差異分析

圖 9 不同品質(zhì)窖泥微生物群落分類Fig. 9 Phylum-level classif i cation of microbial communities in pit mud with different qualities

將窖泥樣品的OTU用Mothur軟件進(jìn)一步分析處理，獲得微生物不同的分類（圖9）。在9 個(gè)窖泥樣品中一共劃分出了9 類細(xì)菌，分別是厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chlorf l exi）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌（Actinobacteria）、無壁菌門（Tenericutes）、螺旋體門（Spirochaetes）、Lebtisphaeria。其中一級(jí)窖泥包括6 類，二級(jí)窖泥包括9 類，三級(jí)窖泥包括8 類。在所有對(duì)比出的細(xì)菌序列中（除去unclassified）可以發(fā)現(xiàn)，每個(gè)窖泥樣品細(xì)菌群落中，占主導(dǎo)地位的都是Firmicutes，這類細(xì)菌具有細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，并且大多數(shù)能夠產(chǎn)生內(nèi)生孢子抵抗極端環(huán)境。其中一級(jí)窖泥樣品（1、2、3號(hào)）中Firmicutes占50%～55%，二級(jí)窖泥樣品（4、6號(hào)）中Firmicutes占41%～43%，三級(jí)窖泥樣品（7、9號(hào)）中Firmicutes占21%～31%。Bacteroidetes的大多數(shù)細(xì)菌寄生在動(dòng)物腸道內(nèi)，有部分屬于病原菌。其中一級(jí)窖泥樣品中Bacteroidetes占1%～3%，二級(jí)窖泥中Bacteroidetes占3%～5%，三級(jí)窖泥中Bacteroidetes占5%～7%。一級(jí)窖泥和二級(jí)窖泥中Proteobacteria都只占1%左右，而三級(jí)窖泥中Proteobacteria占3%～4%。一級(jí)窖泥中Actinobacteria所占比例為5%～11%，二級(jí)窖泥中Actinobacteria占2%左右，三級(jí)窖泥中未發(fā)現(xiàn)有Actinobacteria存在。Tenericutes和Spirochaetes在不同品質(zhì)窖泥中所占比例基本相同，一級(jí)窖泥中未發(fā)現(xiàn)兩種菌的存在，二級(jí)窖泥中兩種菌占1%左右，三級(jí)窖泥中兩種菌分別占2%～5%和2%～4%。Lebtisphaeria在不同品質(zhì)窖泥中所占比例比較一致，都在1%左右?？梢姡煌焚|(zhì)的窖泥中微生物群落結(jié)構(gòu)存在較大差異，與胡曉龍[17]的結(jié)論類似。

2.4 窖泥理化指標(biāo)主成分分析結(jié)果

圖 10 窖泥樣品理化指標(biāo)主成分分布圖Fig. 10 Principal component analysis plot of PC1 versus PC2 for physicochemical indexes

2.5 窖泥微生物群落指標(biāo)與理化相關(guān)性分析結(jié)果

表 2 窖泥微生物群落比例與理化指標(biāo)相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between microbial community and physicochemical indicators of pit mud

由表2可見，總氮含量分別和F i r m i c u t e s、Synergistetes比例呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），和Chlorflexi比例呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），和Proteobacteria比例呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），和Actinobacteria比例呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。氨態(tài)氮含量分別和Firmicutes、Synergistetes比例呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），和Proteobacteria、Spirochaetes比例呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），和Actinobacteria比例呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。有效磷含量和Synergistetes比例呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），和Actinobacteria比例呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。腐殖酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和Proteobacteria比例呈顯著正相關(guān)。pH值和Firmicutes、Actinobacteria比例呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），和Chlorflexi、Spirochaetes比例呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（表2）。所有微生物群落中，Actinobacteria對(duì)理化指標(biāo)變化最敏感，另外Firmicutes、Synergistetes、Proteobacteria對(duì)理化指標(biāo)變化也較為敏感。

圖 11 窖泥理化指標(biāo)和微生物群落冗余分析結(jié)果Fig. 11 Redundancy analysis of physicochemical indexes and bacterial community of pit mud

從圖11可以看出，樣品理化指標(biāo)中氨態(tài)氮、總氮、有效磷含量和pH值對(duì)微生物群落的影響力非常相似，并且影響力度最大，其次分別為水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、腐殖酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、鈣和鐵元素含量。對(duì)于Synergistetes和Actinobacteria，氨態(tài)氮、總氮、有效磷含量和pH值與其比例存在較高的相關(guān)性；對(duì)于Firmicutes，可以看出水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)與其比例有相關(guān)性；而腐殖酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與unclassified比例存在相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果印證了理化指標(biāo)中的氨態(tài)氮、總氮、有效磷含量和pH值對(duì)細(xì)菌存在較大的相關(guān)性，可以反映不同質(zhì)量窖泥中細(xì)菌微生物群落的差異性，從而可作為側(cè)面反映窖泥品質(zhì)的質(zhì)量指標(biāo)。

2.6 窖泥理化指標(biāo)聚類分析結(jié)果

圖 12 窖泥按理化指標(biāo)聚類分析樹Fig. 12 Cluster analysis dendrogram for pit mud samples based on three selected physicochemical indexes

通過SPSS 20軟件中Ward法對(duì)各個(gè)窖泥樣品中的總氮、氨態(tài)氮含量和pH值進(jìn)行聚類分析。從圖12可以看出，窖泥分成了3 類，1、2、3號(hào)窖泥聚為一類，4、5、6號(hào)窖泥聚為一類，7、8、9號(hào)窖泥聚為一類，聚類情況和窖泥品質(zhì)劃分一致，可見這幾種理化指標(biāo)作為窖泥品質(zhì)的劃分標(biāo)準(zhǔn)是合理的。

3 討 論

不同品質(zhì)窖泥的理化指標(biāo)存在顯著差異[18]。本實(shí)驗(yàn)研究了部分不同品質(zhì)窖泥主要理化指標(biāo)的差異并進(jìn)行主成分分析。高品質(zhì)窖泥的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)略高，與感官評(píng)定結(jié)果比較符合。窖泥中的水分除了起物質(zhì)輸送作用外，還對(duì)窖泥中的微生物生長(zhǎng)、代謝起著重要的作用[19]，若水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低會(huì)表現(xiàn)出不同程度的板結(jié)現(xiàn)象，造成微生物生長(zhǎng)繁殖困難，導(dǎo)致部分微生物失活，從而影響到窖泥質(zhì)量，因此窖泥中的水分必須要達(dá)到一定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)才能保障微生物進(jìn)行正常的生理代謝。

總氮、氨態(tài)氮含量隨窖泥品質(zhì)的提高而上升，微生物可有效利用氮元素，并促進(jìn)速效養(yǎng)分的釋放及轉(zhuǎn)運(yùn)，加快對(duì)有毒有害物質(zhì)的降解[20]，從而直接影響常作為窖泥品質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)之一的微生物多樣性及其豐富度。作為總氮的組成部分，氨態(tài)氮可以被窖泥微生物直接利用，其含量在一定程度上體現(xiàn)了窖泥對(duì)微生物生長(zhǎng)代謝所需氮源的供給能力[21]。因此總氮含量以及氨態(tài)氮含量與窖泥品質(zhì)具有一定的相關(guān)性。

不同品質(zhì)窖泥樣品的有效磷、礦質(zhì)元素含量和腐殖酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與窖泥品質(zhì)沒有明顯相關(guān)性，研究表明有效磷含量與土壤中微生物的生物量及代謝物量呈正相關(guān)[22]。腐殖酸作為腐殖質(zhì)的主要成分，由微生物代謝物日積月累而形成，在土壤學(xué)中，其含量能夠反應(yīng)窖泥肥力[23]。腐殖質(zhì)能為部分微生物營(yíng)造良好的生長(zhǎng)環(huán)境，提供相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)成分，具有一定的保水作用，可避免窖泥快速板結(jié)退化，因此腐殖質(zhì)必須要達(dá)到一定的含量。但本實(shí)驗(yàn)中不同品質(zhì)窖泥的有效磷含量與窖泥品質(zhì)沒有明顯的相關(guān)性，這可能與本實(shí)驗(yàn)中材料的采集時(shí)間為后階段有較大關(guān)系。鈣、鐵元素的含量與窖泥的年份呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性[24-25]，從側(cè)面說明“老窖泥”不一定是“好窖泥”，可能是因?yàn)槔辖涯嗟亩啻问褂脤?dǎo)致污染，以及隨著窖泥年份的增加其中部分有益菌退化。由此可見，本實(shí)驗(yàn)中有效磷含量、腐殖酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、鈣和鐵元素含量并不能體現(xiàn)不同等級(jí)窖泥的差異性。

窖泥品質(zhì)越好，其pH值越接近于7，與文獻(xiàn)[26]的結(jié)論相似。弱酸性環(huán)境是窖泥微生物正常代謝繁殖的必要條件，在發(fā)酵過程中對(duì)產(chǎn)酸有較大作用[27]，酸作為酯產(chǎn)物的前體物質(zhì)更是不可或缺的成分。若酸度太高，不耐酸微生物無法進(jìn)行正常的生化作用，達(dá)不到產(chǎn)酯產(chǎn)香的生態(tài)平衡。因此，品質(zhì)較好的窖泥pH值接近中性，可能是窖泥有一定的酸緩沖能力，或者窖池內(nèi)部發(fā)生的某些反應(yīng)轉(zhuǎn)化有機(jī)酸的能力較強(qiáng)。窖泥pH值能反映窖池發(fā)酵是否正常，影響著釀酒微生物自身的繁殖及其參與的生化反應(yīng)。因此企業(yè)一直把pH值作為重要的測(cè)定指標(biāo)，以了解發(fā)酵是否正常，從而進(jìn)一步調(diào)整工藝，保障生產(chǎn)正常進(jìn)行。對(duì)本實(shí)驗(yàn)中所涉及的理化指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，得出氨態(tài)氮、總氮、有效磷含量、pH值、腐殖酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、鐵元素含量對(duì)窖泥品質(zhì)的影響比較大。

窖泥作為微生物的主要棲息場(chǎng)所，對(duì)白酒質(zhì)量有重要影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)9 個(gè)窖泥樣品中的細(xì)菌進(jìn)行分類，一共劃分出了9 類，分別是Firmicutes、Bacteroidetes、Chlorf l exi、Synergistetes、Proteobacteria、Actinobacteria、Tenericutes、Spirochaetes、Lebtisphaeria。隨著窖泥品質(zhì)的提升，F(xiàn)irmicutes、Actinobacteria所占比例有所增大。芽孢桿菌綱和梭菌綱為Firmicutes的主體[28]，窖泥中含有較多的梭菌[29]，其對(duì)濃香型白酒香氣的形成起著非常重要的作用，其主要代謝產(chǎn)物是己酸、丁酸和氫氣[30]。Weimer等[31]得到的Clostridium kluyceri的產(chǎn)己酸質(zhì)量濃度更是達(dá)到了12. 9 g/L。因此，F(xiàn)irmicutes比例較高可能是優(yōu)質(zhì)窖泥釀酒口感優(yōu)于其他窖泥酒的主要原因之一。Bacteroidetes、Proteobacteria所占比例隨著窖泥品質(zhì)的提升有一定程度減少。Chlorf l exi和Synergistetes比例無明顯變化趨勢(shì)。

對(duì)窖泥樣品微生物群落與理化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，表明理化指標(biāo)中總氮、氨態(tài)氮作為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)窖泥微生物群落影響較大。窖泥中的養(yǎng)分并不是越高越好，微生物對(duì)養(yǎng)分的響應(yīng)不同，需要靠工藝去調(diào)整營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量，從而平衡微生物的群落結(jié)構(gòu)，保障發(fā)酵正常進(jìn)行。pH值對(duì)窖泥微生物群落的影響也較大，因此白酒釀造工藝中很注重對(duì)發(fā)酵pH值的控制，如控制投糧的淀粉含量、糟醅的入窖溫度等。

本研究結(jié)果提示了在樣品范圍內(nèi)，總氮、氨態(tài)氮含量與pH值可作為表征窖泥品質(zhì)的理化指標(biāo)，即存在一部分窖泥，在本實(shí)驗(yàn)所測(cè)數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，窖泥品質(zhì)越好，總氮和氨態(tài)氮的含量越高，pH值越接近于7，為窖泥的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了相應(yīng)的數(shù)據(jù)參考。但由于樣品僅來源于一個(gè)工廠，且樣品量較少，僅僅考慮了部分不同品質(zhì)窖泥的差異，因此本研究結(jié)果還有待進(jìn)一步檢驗(yàn)和完善。