錢明華, 王云鵬， 張云， 孫愛君， 于榮敏， 朱建華， 胡云峰

(1.暨南大學(xué) 中藥生物技術(shù)研究所， 廣東 廣州 510632； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院， 廣東 廣州 510006；3.中國科學(xué)院 南海海洋研究所∥中國科學(xué)院 熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室， 廣東 廣州 510301；4.中國科學(xué)院南海海洋研究所∥廣東省海洋藥物重點實驗室， 廣東 廣州 510301)

脂肪酶是一類重要的工業(yè)用酶，在洗滌劑、食品、調(diào)味工業(yè)、生物催化分解藥物及酯類和氨基酸衍生物、合成精細化學(xué)品、農(nóng)藥、生物傳感器、生物修復(fù)、化妝品和香料等工業(yè)均有廣泛的應(yīng)用[1].但是游離的脂肪酶難以回收，不能重復(fù)利用而不利于工業(yè)生產(chǎn).通過使用工業(yè)酶的固定化技術(shù)，可以增加工業(yè)酶的使用次數(shù)，極大地降低工業(yè)酶的使用成本.固定化工業(yè)酶的使用還可以進一步促進產(chǎn)品生產(chǎn)線的自動化，從而降低目標產(chǎn)物分離純化等生產(chǎn)環(huán)節(jié)的成本[2].此外，固定化過程可以增強酶的儲存和酸堿等穩(wěn)定性[3]，從而提高了工業(yè)酶的應(yīng)用性.因此脂肪酶等工業(yè)用酶的固定化技術(shù)具有極高的工業(yè)應(yīng)用價值.

目前，常用的酶固定化方式有4種：吸附法、共價結(jié)合法、包埋法和交聯(lián)法[4].在吸附法中，酶與載體間的作用力較弱，酶容易流失，因而導(dǎo)致固定化酶不穩(wěn)定；在包埋法中，由于載體的限制，酶與底物的接觸存在障礙，使得反應(yīng)速率降低；交聯(lián)法往往作為輔助手段，聯(lián)合其他方法進行固定化；在共價結(jié)合法中，酶分子表面基團可以與載體活性基團間形成共價鍵，因此兩者連接牢固，不易分離，一般具有良好的穩(wěn)定性.由于環(huán)氧基團在常溫下即可與酶蛋白表面的氨基酸殘基(氨基、羧基和巰基等) 發(fā)生溫和的開環(huán)共價結(jié)合，從而將酶分子固定在載體表面[5]，因此環(huán)氧樹脂作為載體在工業(yè)酶固定化領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力.已有科研人員將環(huán)氧樹脂作為載體進行工業(yè)酶的固定化研究，并應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)[6].本研究篩選合適的工業(yè)用環(huán)氧樹脂，嘗試對工業(yè)脂肪酶進行固定化研究，優(yōu)化出最佳固定化條件并考察了固定化酶的穩(wěn)定性，為基于環(huán)氧樹脂共價結(jié)合法固定化脂肪酶等工業(yè)用酶奠定良好工作基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酶與主要試劑

CAS# 9001-62-1脂肪酶，合肥博美生物科技有限責任公司；環(huán)氧樹脂LX-120、LX-1000，西安藍曉科技有限公司生產(chǎn)；環(huán)氧樹脂ES-1、ES-103B、ES-105、ES-107，天津南開和成科技有限公司生產(chǎn)；異辛烷、AR，天津市富宇精細化工有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉均為GENERAY BIOTECH 提供.

1.1.2 儀器與設(shè)備

Infinite M200 Pro多功能酶標儀，瑞士Tecan；MIX-1 振蕩器，上海托莫斯科學(xué)儀器有限公司；TL5R 立式低速冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；OJS-2012R 溫控搖床，上海世平實驗設(shè)備有限公司.

1.2 方法

1.2.1 脂肪酶的預(yù)處理

配制濃度為50 mmol/L、pH為7的PBS緩沖液12 mL，加入酶粉質(zhì)量72 mg，于4 ℃，3 000 r/min離心10 min，取上清液10 mL待用.

1.2.2 脂肪酶的固定化

(1)固定化過程 參考文獻[7-9]，結(jié)合預(yù)試驗結(jié)果，確定脂肪酶的固定化操作流程如下：準確稱取濕載體質(zhì)量1 g，加入處理完的含酶上清液 10 mL，在溫控搖床上40 ℃、200 r/min振蕩反應(yīng)8 h.反應(yīng)完成，過濾并用磷酸鈉緩沖液洗滌，即得固定化酶，晾干12 h，40 ℃烘干4 h，置于 4 ℃ 冷藏柜冷藏備用.

(2)固定化載體的篩選 準確稱取濕載體ES-1、ES-103B、ES-105、ES-107、LX-120、LX-1000質(zhì)量各1 g，加入處理完的含酶上清液10 mL，在溫控搖床上40 ℃、200 r/min振蕩反應(yīng)8 h.反應(yīng)完成，過濾并用磷酸鈉緩沖液洗滌，即得固定化酶，晾干12 h，40 ℃烘干4 h，檢測不同固定化酶酶活力.

(3)緩沖液pH對固定化的影響 準確稱取濕載體LX-120質(zhì)量1 g，加入濃度50 mmol/L、pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的磷酸鈉緩沖液處理所得的含酶上清液 10 mL，在溫控搖床上40 ℃、200 r/min振蕩反應(yīng)8 h.反應(yīng)完成，過濾并用相應(yīng)的緩沖液洗滌，即得固定化酶，晾干12 h，40 ℃烘干4 h，檢測不同固定化酶酶活力.

(4)溫度對固定化的影響 準確稱取濕載體LX-120質(zhì)量1 g，加入濃度50 mmol/L、pH為6.5的磷酸鈉緩沖液處理所得的含酶上清液 10 mL，分別在溫度為20、25、30、35、40、45、50 ℃的溫控搖床上200 r/min振蕩反應(yīng)8 h.反應(yīng)完成，過濾并用相應(yīng)的緩沖液洗滌，即得固定化酶，晾干12 h，40 ℃烘干4 h，檢測不同固定化酶酶活力.

(5)時間對固定化的影響 準確稱取濕載體LX-120質(zhì)量1 g，加入濃度50 mmol/L、pH為6.5的磷酸鈉緩沖液處理所得的含酶上清液10 mL，在溫控搖床上25 ℃、200 r/min分別振蕩反應(yīng)1、2、3、4、5、6 h.反應(yīng)完成，過濾并用相應(yīng)的緩沖液洗滌，即得固定化酶，晾干12 h，40 ℃烘干4 h，檢測不同固定化酶酶活力.

(6)給酶量對固定化的影響 準確稱取濕載體LX-120質(zhì)量1 g，加入濃度50 mmol/L、pH為6.5的磷酸鈉緩沖液處理的含酶量分別為300、400、500、600、700、800、900、1 000 U的上清液 10 mL，在溫控搖床上25 ℃、200 r/min振蕩反應(yīng)2 h.反應(yīng)完成，過濾并用相應(yīng)的緩沖液洗滌，即得固定化酶，晾干12 h，40 ℃烘干4 h，檢測不同固定化酶酶活力.

1.2.3 正交試驗

根據(jù)上述實驗結(jié)果，參考文獻[10]，決定對酶固定化時的溫度、時間、pH、給酶量等4個影響因素進行分析.設(shè)計脂肪酶固定化影響因素的水平(表1).

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗對脂肪酶固定化條件進一步優(yōu)化(表2).

表1固定化正交實驗因素水平表

Table1Theleveltableofimmobilizedorthogonalexperimentalfactors

水平m/(U·g-1)pHT/℃t/h16006.020128006.5252310007.0303

表2固定化L9(34)正交實驗方案

Table2L9(34)orthogonalexperimentalschemeofimmobilization

組號m/(U·g-1)pHT/℃t/h16006.0201.026006.5252.036007.0303.048006.0253.058006.5301.068007.0202.071 0006.0302.081 0006.5203.091 0007.0251.0

1.2.4 固定化酶的穩(wěn)定性

(1)固定化酶的熱穩(wěn)定性 由優(yōu)化所得的條件制備固定化酶，將游離酶和固定化酶分別在30、40、50、60、70、80 ℃保溫2 h，然后測定各酶的酶活力.將游離酶、固定化酶在最佳反應(yīng)溫度60 ℃下分別保溫1、2、3、4、5、6、7 h，然后測定各酶的酶活力.

(2)固定化酶的酸堿穩(wěn)定性 將游離酶和固定化酶在pH分別為 4、5、6、7、8、9、10的環(huán)境下孵育2 h，然后測定各酶的酶活力.

(3)固定化酶的操作穩(wěn)定性 取所制備的固定化酶，60 ℃下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后過濾，濾渣用濃度為0.05 mol/L 的磷酸鈉緩沖液沖洗3遍，重復(fù)反應(yīng)10次.測定每1次反應(yīng)的固定化酶活力.

(4)固定化酶的儲存穩(wěn)定性 將所制備的固定化酶密封、避光存放于4 ℃冷藏柜中.分別在0、5、10、15、20、25、30 d測定酶活力.

1.3 分析方法

1.3.1 游離脂肪酶的酶活測定

脂肪酶酶活定義為：以乳化橄欖油為底物，在測定條件下(40 ℃，pH 7.0)，1 min 內(nèi)催化底物水解產(chǎn)生1 μmol脂肪酸所需的酶量為 1個酶活單位(U).本研究采用改進銅皂-分光光度法的實驗條件和反應(yīng)體系[11]，使用Infinite M200 Pro多功能酶標儀測定.

1.3.2 固定化脂肪酶的酶活測定

精確稱取固定化酶質(zhì)量0.1 g，采用改進銅皂-分光光度法的實驗條件和反應(yīng)體系，使用Infinite M200 Pro多功能酶標儀測量其吸光度.

1.3.3 固定化脂肪酶回收率的計算

固定化脂肪酶酶活回收率的計算公式為：

式中：A為固定化脂肪酶回收率，W0為固定化酶酶活，W1為加入的游離酶總活力，W2為離心后上清液酶活.

1.3.4 正交試驗

1.3.5 相對酶活

在某一參數(shù)的測定過程中，以該實驗中所測定的酶活力最大值為100%，該組實驗其他條件下測定的酶活力與最大值的比值(%)稱為相對酶活.

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化載體的篩選

從多種不同類的環(huán)氧樹脂中篩選了6種環(huán)氧樹脂對脂肪酶進行固定化研究.由于不同的環(huán)氧樹脂的環(huán)氧基團類型、數(shù)目以及樹脂含水量等參數(shù)不同，不同環(huán)氧樹脂對脂肪酶固定化效果有著顯著差異.環(huán)氧樹脂LX-120 固定化效率明顯優(yōu)于其他5種樹脂(圖1).因此選擇環(huán)氧樹脂LX-120作為脂肪酶的固定化載體進一步研究.

2.2 影響脂肪酶固定化的單因素條件優(yōu)化

2.2.1 pH值對酶固定化的影響

其他條件不變，pH值對酶固定化的影響(圖2A).緩沖液的酸堿性對酶活性影響較大[12].強酸強堿甚至?xí)?dǎo)致蛋白質(zhì)變性和失活.當pH 值為5.5到6.5時，隨著pH 值升高，固定化酶酶活升高；當pH超過6.5時，固定化酶酶活隨著pH 值升高而逐漸降低，固定化酶在pH 值為6.5時有最好的固定化效果.因此確定pH 值6.5為最佳固定化pH 值.

圖1 不同環(huán)氧樹脂固定化脂肪酶的效果

2.2.2 反應(yīng)溫度對酶固定化的影響

其他條件不變，反應(yīng)溫度對酶固定化的影響(圖2B).當反應(yīng)溫度為25 ℃時，固定化酶有最好的固定化效果.酶的固定化是一個吸熱的過程[13]，故而在20～25 ℃，固定化酶酶活隨著溫度升高而增加.25～50 ℃，固定化酶酶活逐漸降低.環(huán)氧樹脂固定化酶脂肪酶為共價結(jié)合過程，當溫度超過25 ℃，溫度可能會影響共價鍵的形成[3，14].因此，確定脂肪酶最佳固定化溫度為25 ℃.

2.2.3 反應(yīng)時間對酶固定化的影響

其他條件不變，反應(yīng)時間對酶固定化的影響(圖2C).最佳反應(yīng)時間為2 h.在1 ～2 h內(nèi)，隨著固定化時間的延長，酶與載體結(jié)合越來越牢固，固定化效果也越來越好.2 h后，脂肪酶與載體的結(jié)合到達飽和狀態(tài)，固定化酶的酶活出現(xiàn)下降的趨勢，這與部分文獻[13]結(jié)果一致，造成該實驗現(xiàn)象的原因可能是隨著時間的延長，酶分子活性基團與載體的有效基團結(jié)合，導(dǎo)致蛋白分子結(jié)構(gòu)改變.

2.2.4 給酶質(zhì)量對酶固定化的影響

其他條件不變，給酶質(zhì)量對酶固定化的影響(圖2D).在300～800 U，隨著給酶質(zhì)量的增加，酶與載體結(jié)合越來越多，固定化酶活力也越來越高，酶活回收率隨之降低.隨著吸附質(zhì)量增加，樹脂表面基團結(jié)合達到飽和，脂肪酶難以再吸附到載體表面.達到800 U后，隨著給酶質(zhì)量增加，固定化酶活力變化不大，但是回收率持續(xù)降低.如果繼續(xù)增加給酶質(zhì)量，一方面過多的酶蛋白會增加空間位阻，導(dǎo)致固定化酶活力降低；另一方面，從經(jīng)濟角度考慮，會造成游離酶的浪費.綜上，確定給酶質(zhì)量為800 U.

A：反應(yīng)pH對固定化的影響；B：反應(yīng)溫度對固定化的影響；C：反應(yīng)時間對固定化的影響；D：給酶質(zhì)量對脂肪酶固定化的影響.

A: effect of reaction pH on immobilization; B: effect of reaction temperature on immobilization; C: effect of reaction pH on immobilization; D: effect of enzyme loading on immobilization.

圖2 各因素對固定化的影響

Fig.2 Effect of Various factors on immobilization

2.3 正交實驗結(jié)果

實驗結(jié)果可見4個因素對固定化的影響從大到小依次為給酶質(zhì)量(A)、固定化溫度(C)、pH(B)、固定化時間(D)(表3)，而由正交實驗結(jié)果進行方差分析(表4)可知，4個因素中，給酶質(zhì)量(A)對固定化有顯著影響(F比=3.728>F臨界=3.110)，與給酶質(zhì)量對固定化有最大影響的分析結(jié)果一致.正交實驗優(yōu)化所得最佳的固定化條件組合為A1B2C3D3，即給酶質(zhì)量600 U， pH 6.5，固定化3 h，固定化溫度30 ℃；由上述條件制備所得的固定化酶酶活回收率最高，為95.42%，此時固定化酶酶活力為(357.03±7.09) U/g.

2.4 固定化脂肪酶的穩(wěn)定性

2.4.1 固定化酶的熱穩(wěn)定性

固定化酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，和游離酶的最適反應(yīng)溫度基本一致(圖3A).將固定化酶在最佳反應(yīng)溫度60 ℃下分別保溫1、2、3、4、5、6、7、8 h，然后測定各酶的酶活力(圖3B).隨著保溫時間的延長，固定化酶的酶活呈下降的趨勢.保溫7 h，固定化酶活力保留66.21%，而游離酶活力保留約55.47%，固定化酶的熱穩(wěn)定性整體優(yōu)于游離酶(圖3).

表3環(huán)氧樹脂共價結(jié)合固定化脂肪酶L9(34)正交實驗結(jié)果1)

Table3L9(34)orthogonalexperimentalresultsofepoxyresinwithcovalentlyimmobilizedLipase

實驗號(A)m/(U·g-1)(B) pH(C)T/℃(D)t/h固定化酶酶活回收率/%1111175.892122286.823133387.514212360.545223165.286231254.247313245.498321345.809332138.86K1250.22181.92175.93180.03K2180.06197.90186.22186.55K3130.15180.61198.28193.85k183.4160.6458.6460.01k260.0265.9762.0762.18k343.3860.2066.0964.62極差R40.035.777.454.61主次順序w>T>pH>t優(yōu)水平A1B2C3D3優(yōu)組合A1B2C3D3

1)K為該因素在該水平下酶活力回收率之和；k為該因素在該水平下酶活回收率平均值；R為各因素極差.

表4L9(34)正交實驗結(jié)果方差分析

Table4AnalysisofvarianceofL9(34)orthogonalexperimentalresults

方差來源m/(U·g-1)1)pHT/℃t/h偏差平方和2 425.5861.7883.4331.87自由度2222F比3.7280.0950.1280.049F臨界值(a=0.10)3.1103.1103.1103.110

1)F比>F臨界值(a=0.10)表示該因素具有統(tǒng)計學(xué)差異.

2.4.2 固定化酶的酸堿穩(wěn)定性

游離酶的最適反應(yīng)pH為4，而固定化酶的最適反應(yīng)pH為7左右(圖4A)；在pH大于6 的環(huán)境中，酶活力均隨著pH增加而降低，但是同一pH下，固定化酶的酶活力保留均高于游離酶(圖4B).因此，固定化酶的酸堿穩(wěn)定性整體優(yōu)于游離酶.

2.4.3 固定化酶的操作穩(wěn)定性

固定化酶的操作穩(wěn)定性決定了固定化酶的重復(fù)使用性能(圖5A).隨著使用次數(shù)的增加，固定化酶的酶活逐漸降低.連續(xù)使用10次后，固定化酶的酶活仍保留初始酶活的64.21%.因此，此脂肪酶經(jīng)固定化后具有較好的操作穩(wěn)定性；相比較游離酶以粉狀形式在溶液中起作用，1次使用后即很難回收使用，從而增大了工業(yè)酶的使用成本.

2.4.4 固定化酶的儲存穩(wěn)定性

環(huán)氧樹脂儲存穩(wěn)定性是固定化酶穩(wěn)定性的重要應(yīng)用指標(圖5B).基于環(huán)氧樹脂制備的固定化脂肪酶在儲存30 d后，固定化酶活力保留78.14%，因此，所制備的固定化脂肪酶具有良好的儲存穩(wěn)定性.

A：固定酶和游離酶的最適反應(yīng)溫度；B：游離酶和固定化酶在60 ℃下的熱穩(wěn)定性比較.

A：固定酶和游離酶的最適反應(yīng)pH；B：游離酶和固定化酶pH穩(wěn)定性.

A：固定化酶操作穩(wěn)定性；B：固定化酶儲存穩(wěn)定性

3 討論

目前，應(yīng)用于固定化的環(huán)氧樹脂多為Eupergit C等昂貴的國外進口環(huán)氧樹脂[15-16]，如Knezevic等[6]在Eupergit C上固定化褶皺假絲酵母脂肪酶(pH 7.0，4 ℃，48 h)，當給酶質(zhì)量分數(shù)為6.0 mg/g時，酶活回收率高達92.5%；該固定化酶50 ℃保溫7 h，酶活保留約22%，75 ℃保溫7 h，酶活保留約18%.Martín等[8]在Eupergit C上固定化環(huán)糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶(pH 7.0，25 ℃，48 h)，當給酶質(zhì)量濃度為8.1 mg/mL時，固定化酶酶活回收率約為80%，可溶性和固定化的酶表現(xiàn)出相似的最佳溫度和pH值，但固定化酶的最佳pH值更高；該固定化酶在85 ℃下保溫1 h，酶活保留90%；重復(fù)操作10次，酶活保留40%.本研究與Eupergit C樹脂相比，國產(chǎn)環(huán)氧樹脂LX-120對脂肪酶的固定化性能相似，酶活回收率高達95.42%；與游離酶相比，固定化脂肪酶的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性均有明顯提升；固定化脂肪酶在連續(xù)反應(yīng)10次后，酶活仍保留64.21%，操作穩(wěn)定性較好；固定化脂肪酶在4 ℃下儲存30 d，仍保留78.14%的活力；且固定化反應(yīng)過程條件溫和(pH 6.0，30 ℃)，固定化時間只需3 h，對脂肪酶的活性影響小，應(yīng)用于脂肪酶的工業(yè)固定化較為便利，所得的固定化酶在某些性能上甚至更優(yōu)良.

本研究以國產(chǎn)工業(yè)用環(huán)氧樹脂LX-120為載體，通過共價結(jié)合法固定化重要的工業(yè)用酶—脂肪酶.在對環(huán)氧樹脂固定化脂肪酶的反應(yīng)條件進行優(yōu)化后，所制備的固定化酶酶活可達(357.03±7.09)U/g；由于環(huán)氧樹脂是依靠環(huán)氧基團與脂肪酶反應(yīng)進行固定化的，酶活回收率高達95.42%.而且本研究中基于環(huán)氧樹脂制備的固定化脂肪酶具有良好的操作穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，固定化酶的溫度及酸堿度適用范圍更廣.

有研究表明，有機相中對某些酶共價固定化有利于維持酶蛋白的天然構(gòu)象，一定程度克服傳統(tǒng)水相中共價固定化導(dǎo)致的酶失活現(xiàn)象[17]，因此后續(xù)本研究小組將繼續(xù)探討有機試劑及金屬離子對LX-120固定化脂肪酶的影響.