王華光,王文靜,盛彥清*

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污水處理工藝對微藻及藻際細菌群落的影響

王華光1,王文靜2,盛彥清2*

(1.煙臺振德環(huán)境監(jiān)測有限公司,山東 煙臺 264000；2.中國科學院煙臺海岸帶研究所,山東 煙臺 264003)

以某啤酒廠活性污泥作為接種物富集對污水有降解作用的微藻與細菌,探討藻菌共生體在經(jīng)過不同處理的污水培養(yǎng)基中生長情況及藻菌群落結(jié)構(gòu)的變化.微藻在兩個處理組Treat. 1(過濾且滅菌污水)和Treat. 2(過濾未滅菌污水)中均生長良好;培養(yǎng)20d后,微藻和細菌在不同污水處理組中群落結(jié)構(gòu)與原樣相比,發(fā)生了顯著的變化:隨著藻菌在污水培養(yǎng)基中生長,萊茵衣藻和小球藻在Treat. 1和Treat. 2中成為優(yōu)勢藻類;無色桿菌屬unidentified OPB35的相對豐度在兩組實驗組中均明顯增加,溶桿菌在Treat. 1和Treat. 2中顯著減少.藻菌共生體對Treat. 1和Treat. 2中的化學需氧量(COD)去除率可達到73.7%和67.9%.結(jié)果表明,Treat. 1和Treat. 2中的污水培養(yǎng)基對微藻及細菌的群落結(jié)構(gòu)有顯著的影響,但不同處理組中不同藻菌共生體對培養(yǎng)液的CODCr去除無明顯的區(qū)別.

微藻；藻際細菌；污水處理；CODCr

隨著全球能源危機和水體環(huán)境污染的加劇,利用污水擴大培養(yǎng)微藻提取生物柴油的工藝逐漸成為解決水環(huán)境污染和能源危機的新興研究熱點[1-2].已有研究表明,微藻對污水中的有機物、氮、磷等均具有較好的去除效果[3-5]:如藍藻門布朗葡萄藻()對含有較高碳氫化合物濃度的經(jīng)二級處理污水中的硝酸鹽和磷具有較好的去除效果,同時得到比標準培養(yǎng)基培養(yǎng)更高的生物量[6];斜生柵藻()和小球藻(),藍藻鈍頂螺旋藻()與活性污泥菌落的相互作用時,可有效去除豬養(yǎng)殖廢水中的C、N、P等[7];利用好氧污泥-微藻耦合顆粒進行污水處理的研究目前獲得了較好的研究成果[8];微囊藻對銻的吸附及去除也有較好的效果[9].

制約污水培養(yǎng)微藻反應器的關鍵技術問題是污水中含有較多的雜質(zhì)和微生物,如各種細菌、寄生蟲、原生動物和輪蟲等,從而導致微藻生長不夠穩(wěn)定,微藻產(chǎn)量低和出水水質(zhì)差[10].近年來研究發(fā)現(xiàn),由于細菌和微藻之間存在著互利共生,偏利共生等多種關系,部分細菌對微藻的生長和絮凝沉淀都有積極作用[11].藻菌關系的重要性在污水培養(yǎng)微藻獲得微藻能源方面越來越受到重視,諸多相關研究正在有序開展[12-15].已有研究結(jié)果表明,將微藻和細菌進行有效結(jié)合形成運行簡便、經(jīng)濟有效的污水處理工藝,可很好的解決微藻在復雜污水中生長不穩(wěn)定的問題.但隨著藻菌在污水中培養(yǎng),藻類和細菌的種群結(jié)構(gòu)極易發(fā)生變化.本文擬從微藻和細菌共生的角度出發(fā),從某啤酒廠污水處理系統(tǒng)的好氧池中富集微藻,考察好氧池中微藻群落結(jié)構(gòu)變化及藻際細菌在處理污水前后的群落結(jié)構(gòu)多樣性變化,同時檢測其對不同污水處理組中COD的去除效果.

1 材料與方法

1.1 微藻的獲取培養(yǎng)

取20mL污泥濃度(MLSS)4 000mg/L某啤酒廠污水處理系統(tǒng)的好氧池內(nèi)活性污泥作為接種物,加入0.5L自制的無菌營養(yǎng)液(pH 7.0,121℃,30min)于1L無菌錐形瓶中,營養(yǎng)液中含硝酸鈉(15.0g/L),磷酸氫二鉀(4g/L),七水合硫酸鎂(7.5g/L),七水合氯化鈣(3.6g/L),檸檬酸(0.6g/L),檸檬酸鐵銨(0.6g/L),乙二胺四乙酸二鈉(0.1g/L),碳酸鈉(2.0g/L),硼酸(2.86g/L),氯化錳(1.86g/L),硫酸鋅(0.22g/L),鉬酸鈉(0.39g/L),五水硫酸銅(0.08g/L),六水硫酸鈷(0.05g/L),九水硅酸鈉(4g/L),維生素B1(0.1mg/L),維生素B12(0.5mg/L)和生物素(0.5mg/L).接種活性污泥后無菌錐形瓶置于光照強度為2000lux,25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中.培養(yǎng)2個月后,取培養(yǎng)液在5 000g,10min的條件下,離心收集藻細胞.

取上一步驟中的原樣藻細胞,清洗離心后的藻細胞分別接入經(jīng)過不同處理工藝的培養(yǎng)液中. Treatment 1 (Treat. 1):濾紙(定量濾紙,中速)過濾啤酒廠污水并置于121℃,30min條件下進行高溫滅菌;Treatment 2 (Treat. 2):使用濾紙過濾啤酒廠污水.每個實驗組3個重復,定時取樣.

依據(jù)文獻[16]的方法,用紫外分光光度計測定微藻在波長666nm和653nm下的吸光度,葉綠素(Chlorophyll)的計算公式為:

Chlorophyll a (a)=15.65666?7.340653 (1)

Chlorophyll b (b)=27.05653?11.21666 (2)

Total chlorophyll=a+b (3)

實驗過程中,取培養(yǎng)液0.45μm GF/C濾膜(waterman)過濾后,留上清液.COD的測定采用標準方法[17].

1.2 藻菌樣品的采集及總DNA提取

分別取50mL原樣、Treat. 1和Treat. 2 樣品,超聲處理后,經(jīng)0.45μm聚碳酸酯膜濾膜(Millipore, Cork, Ireland)過濾后收集含有藻細胞的濾膜1,濾膜1放置于滅菌后的2mL的離心管中;收集濾液,濾液經(jīng)0.2μm聚碳酸酯膜濾膜(Millipore, Cork, Ireland)過濾后,收集濾膜2放置于滅菌后的2mL的離心管中.濾膜置于-20℃的冰箱中保存.利用植物和細菌總DNA提取試劑盒(OMEGA,USA)分別提取濾膜1中微藻總DNA和濾膜2中細菌總DNA,瓊脂糖DNA純化試劑盒(天根生化科技北京有限公司)純化,純化后DNA保存在-80℃.高通量測序?qū)嶒炍腥A大基因有限公司針對16S rRNA基因V4~V5區(qū)域完成.原始測序數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(SRR7091132-SRR7091137).使用Cut adapt軟件過濾和按barcode拆分樣本后,進行OTUs (Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類分析.根據(jù)OTUs聚類結(jié)果,一方面對每個OTU的代表序列做物種注釋,得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況.對OTUs進行豐度、Alpha多樣性計算、Venn圖和花瓣圖等分析,以得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等.另一方面,可以對OTUs進行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,并進一步得到不同樣品和分組的群落結(jié)構(gòu)差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 微藻的生長

通過測定藻細胞的葉綠素a和葉綠素b含量,確定藻類在污水培養(yǎng)基中的生長狀態(tài).實驗表明藻類在Treat. 1和Treat. 2中均生長良好(圖1).0~20d,藻類在Treat. 1和Treat. 2的葉綠素的含量沒有明顯的區(qū)別.20d后,在Treat. 2中藻細胞的葉綠素含量明顯高于Treat. 1藻細胞的葉綠素.與Treat. 2相比Treat. 1中缺少污水中有活性的細菌,大量有益于藻類生長的細菌在過濾污水中存在,有益細菌促使藻類更好的利用過濾污水中的營養(yǎng)物質(zhì).遲堃[18]和陶羽[19]研究污水處理菌藻共生系統(tǒng)時,發(fā)現(xiàn)細菌可促使藻體形成絮狀沉淀,有利于藻類生長.實驗表明:經(jīng)過滅菌和未滅菌的過濾污水對微藻的生長沒有顯著影響,實驗室中未滅菌的過濾污水更有益于微藻的生長.

圖1 微藻的葉綠素含量隨生長時間的變化情況

2.2 微生物群落多樣性

利用Illumina Miseq平臺對藻類18S rRNA 基因和細菌16S rRNA基因測序,共得到原始序列502926條,經(jīng)過篩選后,共得到有效序列42966條(表1).表1中,綜合考慮Chao1指數(shù),Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù),實驗組Treat. 1和Treat. 2中微藻和細菌群落多樣性要低于原樣樣品,實驗組Treat. 2的微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性要高于實驗組Treat. 1的微生物群落多樣性.這可能是由于微生物Treat. 1和Treat. 2中逐漸被馴化,微生物種類趨向單一化,與污水處理關系密切的微藻和細菌在實驗組中形成新的藻菌共生體并且逐漸成為優(yōu)勢細菌,而實驗組Treat. 2中加入了污水培養(yǎng)基中原有的細菌,導致微生物群落多樣性高于實驗組Treat. 1.

2.2.1 微藻群落結(jié)構(gòu)多樣性 實驗過程中,收集富集培養(yǎng)的原樣、Treat. 1和Treat. 2等樣品,提取微藻和細菌總DNA,對微藻和藻際細菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性進行測定,同時對微藻和細菌在種或?qū)偎较鄬ωS度大于1%種類進行分析.基于18S rDNA對微藻群落多樣性進行分析,在原樣樣品中檢測到3種微藻,其中包括硅藻門(Diatomea),紅藻門(Rhodophyta)和綠藻門(Chlorophyta)(圖2A).污水處理過程中常用綠藻,如萊茵衣藻() (44.6%)、麥可藻屬(9.2%)和(4.6%)[20-22]是原樣樣品中的優(yōu)勢藻類.

隨營養(yǎng)條件的改變,實驗組Treat. 1與原樣樣品相比優(yōu)勢藻類種群沒有發(fā)生明顯變化,如綠藻和硅藻依然作為藻類群落中的優(yōu)勢種群.綠藻相對豐度增加,包括(47.6%),(5.5%),(3.9%),sp. (2.9%)和sp. (10.1%)等;而(8.0%)相對豐度明顯減少(圖2B).硅藻相對豐度(27.9%)與原樣相比有所減少,紅藻sp. (3.1%)的相對豐度沒有發(fā)生明顯變化.微藻接種至含污水原生細菌的Treat. 2后,優(yōu)勢微藻群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化:綠藻相對豐度明顯增加,硅藻相對豐度減少,未檢測到紅藻;同時(49.4%),(22.2%)和(25.4%)等成為優(yōu)勢群;檢測到未在原樣和Treat. 1中出現(xiàn)的綠藻門綠球藻sp. (0.1%).sp.是一種潛在可利用的微藻能源的微藻,Sivasubramanian等[23]和Renuka等[24]研究中證實_sp.可利用污水處理后的出水進行生長并獲得較高生物量,為未來新能源的可持續(xù)發(fā)展利用提供可能.綠藻如(25.4%)、(1.7%)和硅藻(0.6%)的相對豐度與原樣相比明顯減少,而紅藻sp. Y16沒有檢測到.兩組實驗過程中發(fā)現(xiàn)和在污水培養(yǎng)基中作為優(yōu)勢藻類,是污水處理研究過程中的常見菌株.在Treat. 1中的相對豐度高于的相對豐度,在過濾并滅菌污水處理組Treat. 2則反之.微藻在Treat. 2生長時,過濾污水中存在較多的細菌種類,過濾污水滅菌后,諸多有益于的細菌被殺死,與z在實驗組Exp. 2相互競爭營養(yǎng)物質(zhì),最終成為優(yōu)勢藻類.實驗結(jié)果證實:對污水進行不同的處理會對藻類群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,微藻群落隨著污水培養(yǎng)基的變化而變化.

表1 微藻和細菌的豐度和多樣性

圖2 微藻群落結(jié)構(gòu)多樣性

A.門; B.種

2.2.2 細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性 基于16S rRNA基因,對藻類共生的藻際細菌進行細菌群落結(jié)構(gòu)的測定(圖3).結(jié)果顯示,Treat. 1和Treat. 2中的細菌與原始樣品相比,細菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯.在門的水平上,原始樣品和Treat. 1較為接近,而在屬的水平上,過濾污水處理組和滅菌污水處理組群落結(jié)構(gòu)較為接近.3個處理組中共檢測到9個門類,包括變形桿菌門(Proteobacteria),擬桿菌門(Bacteroidetes),浮霉菌門(Planctomycetes),芽孢桿菌門(Gemmatimonadetes),綠菌門(Chlorobi),棲熱鏈球門(Deinococcus- Thermus),厚壁桿菌門(Firmicutes),綠彎菌門(Chloroflexi),酸桿菌門(Acidobacteria)和其他(others).變形菌門的含量超過79%,尤其原樣的微藻樣品中變形菌門的含量達到95%以上.隨著藻類在Treat. 1和Treat. 2培養(yǎng),變形菌門的含量變低,而擬桿菌門在Treat. 1中的含量有所升高,綠菌門和浮霉菌門在Treat. 2中含量亦有所升高.

圖3 藻際細菌群落結(jié)構(gòu)組成

A.門;B.屬

在屬的水平上,微藻原樣中,藻際細菌群落中溶桿菌()相對豐度可達87.4%,其次unidentified和紅桿菌屬()分別占7.8%和4.6%.微藻在Treat. 1和Treat. 2培養(yǎng)后,由于營養(yǎng)物質(zhì)改變及污水中自帶菌群等原因,細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化.在Treat. 1中,營養(yǎng)條件改變后,藻類群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,藻際細菌群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化.貪噬菌()的相對豐度達到43.7%,其次為unidentified OPB35 (35.4%),無色桿菌() (10.7%)次之.而在含有自養(yǎng)細菌的Treat. 2中,藻際細菌群落多樣性再次發(fā)生變化, unidentified OPB35 (35.4%)相對豐度最高,其次unidentified(21.0%)和無色桿菌(12.4%).溶桿菌()在Treat. 1和Treat. 2中豐度銳減,而原樣中未檢測到的unidentified OPB35在Treat. 1和Treat. 2中出現(xiàn)較高豐度.微藻在利用污水營養(yǎng)物質(zhì)的同時,不僅微藻群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,細菌群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化.污水中的細菌群落影響微藻群落結(jié)構(gòu),進而影響新的藻菌共生體的形成.

2.3 CODCr的變化

利用重鉻酸鉀法測定微藻及藻際細菌在污水處理過程中COD的變化,實驗初始,過濾污水培養(yǎng)基和滅菌污水培養(yǎng)基的CODCr值為480mg/L.原樣微藻在Treat. 1和Treat. 2中培養(yǎng)20d后,利用GF/C濾膜去除藻細胞,測定濾液的CODCr的變化. Treat. 1中CODCr值降低至128mg/L, Treat. 2的CODCr值降低至154mg/L.微藻對2種污水培養(yǎng)基中的CODCr去除率可分別達到73.7%和67.9%.實驗證明,污水原樣富集的微藻對污水中CODCr的去除具有一定的效率,藻際細菌的存在對CODCr的去除率沒有明顯影響,減少污水培養(yǎng)基的凈化處理,在一定程度上可降低污水處理工藝的成本,在實際生產(chǎn)中有一定的參考意義.

綜上所述,微藻細胞周圍生長著大量共棲的細菌,微藻處理污水實際是藻類及藻際細菌的共生體在污水中產(chǎn)生的效果.藻際細菌不僅與微藻進行相互作用,還對污水中的營養(yǎng)物質(zhì)進行分解利用.研究表明,藻際細菌中可能存在著制約藻細胞生長的不利細菌,也存在大量促進藻類生長的細菌.微藻與藻際細菌群落的優(yōu)化組合,篩選得到有益的菌群是獲取高效污水處理的微藻的重要途徑.通過對藻菌相互關系的深入研究,不僅可以篩選高效污水處理的微藻,而且獲得藻菌共生體的更好的污水處理組合.

圖4 不同處理組中CODCr的變化情況

3 結(jié)論

3.1 微藻在兩個實驗組中生長良好.隨著藻菌的生長,微藻和細菌優(yōu)勢群落結(jié)構(gòu)在不同處理組中發(fā)生顯著變化.

3.2 綠藻和細菌在兩組實驗室中作為優(yōu)勢群落.

3.3 在不同前處理的污水培養(yǎng)基中,原樣藻菌群落中形成新的藻菌共生體.這些藻菌共生體對在兩組實驗中的COD去除率沒有明顯差別.

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Influences of sewage treatments technologies on microalgae and bacteria community structures.

WANG Hua-guang1, WANG Wen-jing2, SHENG Yan-qing2*

(1.Yantai Zhen De Testing Group Company, Yantai 264000, China；2.Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Science, Yantai 264003, China)., 2018,38(10)：3761~3766

Microalgae and bacteria communities related to sewage treatments were cultured with activated sludge from a brewery. And then, they were used to treat sewage from the brewery under two experimental conditions: Treatment 1 (Filtered and sterilized sewage) and Treatment 2 (filtered but unsterilized sewage). Compositions of microalgae and bacteria communities were analyzed during the experiments. After 20 days incubation, microbial community structures notably changed in all treatments.andsp. became dominant bacteria communities in Treatment 1and Treatment 2, and the abundances of unidentified OPB35increased significantly. Butdecreased significantly in two treatments. The removal rates of chemical oxygen demand (COD) in Treat. 1and Treat. 2were 73.7% and 67.2%, respectively. What is more, microalgae grew well in the two treatments. Results showed that microalgae communities significantly influenced bacteria community compositions in Treat. 1and Treat. 2and there were no significantly differences in the removal efficiencies of CODCrin two treatments.

microalgae；associated bacteria；sewage treatment；CODCr

X172

A

1000-6923(2018)10-3761-06

王華光(1986-),男,山東煙臺人,工程師,碩士,從事水環(huán)境治理.發(fā)表論文5篇.

2018-03-14

國家自然科學基金資助項目(31600370,41373100);煙臺市重點研發(fā)計劃(2018ZHGY080,2018ZHGY083)

* 責任作者, 研究員, yqsheng@yic.ac.cn