劉樹(shù)麗，段正洋，徐龍乾，徐曉軍，宋淑敏，張夢(mèng)嬌

（昆明理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，昆明 650500）

鉛可以應(yīng)用于很多領(lǐng)域，如鉛酸電池、建筑材料、印刷、染料和礦物燃料等[1-2]。然而，鉛是一種毒性很強(qiáng)的重金屬，環(huán)境中過(guò)量的鉛暴露能夠破壞生態(tài)系統(tǒng)。鉛不能被微生物降解，含鉛廢水如未有效處理，極易造成鉛的轉(zhuǎn)移和積累，即使低濃度鉛也會(huì)對(duì)人體的神經(jīng)、消化和腎臟等系統(tǒng)以及環(huán)境造成危害[3]。將鉛從水溶液中有效分離，不僅能夠回收利用鉛資源，還能保護(hù)人類(lèi)和生態(tài)系統(tǒng)的安全。目前處理含鉛廢水的方法有化學(xué)沉淀、電化學(xué)、氧化還原、離子交換、溶液萃取、絮凝、吸附和生物吸附等。其中生物吸附法具有去除率高、處理成本低、生物吸附材料來(lái)源廣泛、吸附劑容易再生和無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，因此在重金屬處理方面受到廣泛的關(guān)注。

生物吸附法是通過(guò)某些生物體本身及其胞外分泌物吸附水溶液中的金屬離子，使固相和液相進(jìn)行分離從而去除水中金屬離子的方法[4]。近年來(lái)，細(xì)菌、真菌、藻類(lèi)等微生物已被廣泛用于水中重金屬的處理。目前，微生物作為吸附劑去除鉛的研究多集中在微生物的篩選分離、微生物及其胞外分泌物的吸附能力、微生物的預(yù)處理和改性、吸附模型（吸附等溫線和吸附動(dòng)力學(xué)）、吸附機(jī)理以及其潛在的應(yīng)用價(jià)值。盡管自然界中存在各種各樣的微生物，但是篩選出具有耐受性及高效結(jié)合重金屬能力的微生物是處理含重金屬?gòu)U水的關(guān)鍵步驟。許多微生物都能去除Pb（Ⅱ），細(xì) 菌 中 的 Bacillus sp.、Corynebacterium glutamicum、Pseudomonas aeruginosa、Enterobacter sp.和 Streptomy?ces rimosus等，真菌中的Saccharomyces cerevisiae、Peni?cillium sp.和Aspergillus sp.等，以及藻類(lèi)中的褐藻（Pa?dina tetrastomatica等）、綠藻（Cladophora glomerata等）和紅藻（Gracilaria corticata等）[5]。除此之外，一些微生物的胞外分泌物（EPS）也能有效去除水中的鉛，如Bacillus sp.[6]、Shewanella oneidensis[7]和 Aspergillus fu?migatus[8]等微生物產(chǎn)生的分泌物就能夠吸附鉛。微生物對(duì)重金屬吸附能力的研究，主要是對(duì)其影響因素如pH值、吸附劑用量、重金屬濃度、溫度、吸附等溫線及吸附動(dòng)力學(xué)等方面，以便得到最佳的吸附條件。微生物細(xì)胞的細(xì)胞壁組成物質(zhì)中，含有羥基、羧基、氨基和磷酸基等基團(tuán)，這些基團(tuán)能通過(guò)離子交換、絡(luò)合、靜電吸引、吸附和螯合等作用結(jié)合重金屬離子[9]。由于微生物所含有的官能團(tuán)的數(shù)量有限，為了提高其吸附能力，近年來(lái)，化學(xué)和基因改性微生物的方法經(jīng)常被用于提高微生物的生物吸附能力。Zhang等[10]制備的納米-ZnO酵母菌可以明顯提高水溶液中鉛的去除能力；Montazer-Rahmatia等[11]使用化學(xué)試劑甲醛（FA）、戊二醛（GA）、聚乙烯亞胺（PEI）、CaCl2和HCl處理褐藻，提高了其吸附能力的穩(wěn)定性；楊婷[12]利用基因工程技術(shù)，將枯草芽孢桿菌的抗砷基因arsR通過(guò)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌內(nèi)，誘導(dǎo)合成砷調(diào)節(jié)蛋白ArsR，用于砷的富集和去除。

通過(guò)化學(xué)或基因改性的方法能夠提高微生物去除重金屬的能力，但許多學(xué)者的研究也表明不同的微生物其死細(xì)胞或活細(xì)胞的吸附能力不同。在多數(shù)的研究中，微生物的死細(xì)胞比活細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的吸附 能 力 。 Velásquez等[13]研 究 了 Bacillus sphaericus OT4b31和Ⅳ（4）10處于生長(zhǎng)中的活細(xì)胞和經(jīng)過(guò)處理的死細(xì)胞對(duì)Cr（Ⅵ）吸附，死菌體是經(jīng)過(guò)pH為2.5的酸化去離子水（H2SO4）處理后，再經(jīng)80℃烘干后得到，研究結(jié)果表明，Bacillus sphaericus OT4b31和Ⅳ（4）10的活細(xì)胞對(duì)Cr（Ⅵ）的去除率分別為25%和32%，而相應(yīng)的死細(xì)胞對(duì)金屬Cr（Ⅵ）的去除率分別為44.5%和45%，死細(xì)胞的生物吸附能力高于活細(xì)胞，可能是由于經(jīng)過(guò)處理的死細(xì)胞暴露出了更多的結(jié)合位點(diǎn)。Huang等[14]研究了Bacillus cereus RC-1培養(yǎng)后離心獲得的活細(xì)胞和經(jīng)過(guò)121℃、20 min處理的死細(xì)胞對(duì)Cd（Ⅱ）的吸附能力，結(jié)果為死細(xì)胞的吸附能力高于活細(xì)胞，且FTIR分析表明經(jīng)過(guò)高溫處理的Bacillus cere?us RC-1的死細(xì)胞暴露出更多的-COOH，從而提高了吸附量。Du等[15]使用Pseudomonas sp.strain DY1培養(yǎng)后獲得的活菌體和高溫處理的死菌體（100℃30 min）吸附水溶液中金屬絡(luò)合染料酸性黑172，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表現(xiàn)出死菌體的吸附能力高于活菌體，高溫處理的死菌體具有更強(qiáng)的吸附能力，是由于死細(xì)胞具有更高的細(xì)胞滲透性且細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性后氨基基團(tuán)起到了重要的作用。但有些微生物經(jīng)過(guò)滅活處理后，其死細(xì)胞的去除能力低于活細(xì)胞。Sayyadi等[16]研究Saccharomyces carlsbergensis PTCC 5051去除Cd（Ⅱ）和Cs（Ⅰ）時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)高溫滅菌處理，含有NaN3或2，4二硝基酚的氨丁三醇緩沖劑處理的Saccharomyces carlsbergensis PTCC 5051的死細(xì)胞的生物吸附能力明顯低于活細(xì)胞。Malkoc等[17]研究Variovorax paradoxus和Arthrobacter viscosus對(duì)Zn（Ⅱ）的生物吸附能力時(shí)，發(fā)現(xiàn)Variovorax paradoxus的活細(xì)胞的吸附能力高于死細(xì)胞，而Arthrobacter viscosus的活細(xì)胞的吸附能力低于死細(xì)胞。對(duì)于不同的微生物，經(jīng)過(guò)一些方法處理后得到的死細(xì)胞（例如高溫處理），相對(duì)于活細(xì)胞，其吸附能力不同且吸附能力差異的機(jī)理也不同。Huang等[14]和Du等[15]的研究表明死細(xì)胞的吸附效果高于活細(xì)胞，但是兩者死細(xì)胞吸附能力提高的機(jī)理是不同的。因此，本研究選用實(shí)驗(yàn)室篩選出的克雷伯氏菌作為目標(biāo)菌種，研究其死細(xì)胞和活細(xì)胞對(duì)鉛的去除能力。

克雷伯氏菌普遍存在于土壤、水體、谷物等自然環(huán)境以及生物體的消化、呼吸系統(tǒng)中?？死撞暇鷮儆诟锾m氏陰性菌，根據(jù)近幾年相關(guān)研究與報(bào)道，其在污水處理及重金屬治理方面具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力。Mu?oz等[18]研究了從污水處理廠中分離出的克雷伯氏菌3S1對(duì)水中Pb（Ⅱ）的吸附能力；信欣等[19]研究了克雷伯氏菌的胞外分泌物去除水中的Pb（Ⅱ）；Yang等[20]利用克雷伯氏菌的胞外分泌物同時(shí)去除水中的Cu（Ⅱ）和Zn（Ⅱ）?？死撞暇€被用于水中有機(jī)物的降解[21]。但是對(duì)克雷伯氏菌活細(xì)胞和通過(guò)高溫處理后的死細(xì)胞吸附重金屬能力的對(duì)比研究鮮見(jiàn)報(bào)道。所有對(duì)于微生物作為生物吸附劑的研究都是為實(shí)際應(yīng)用作指導(dǎo)，因此選擇安全、高效的微生物是關(guān)鍵的部分，若選用的微生物具有致病性等則會(huì)造成處理重金屬以后產(chǎn)生二次污染等環(huán)境問(wèn)題。本研究中選用的克雷伯氏菌，是一種具有致病性的微生物?？死撞暇饕蟹窝卓死撞暇⒊舯强死撞暇捅怯步Y(jié)克雷伯氏菌。克雷伯氏菌有較高的發(fā)病率和死亡率，該菌能夠?qū)е箩t(yī)院內(nèi)新生兒呼吸道和泌尿系統(tǒng)的感染，還會(huì)引發(fā)菌血病和燒傷患者的感染。尤其是肺炎克雷伯氏菌引起的肺炎，此菌存在于人體腸道、呼吸道，可引起支氣管炎、肺炎，泌尿系和創(chuàng)傷感染，甚至敗血癥、腦膜炎、腹膜炎等。對(duì)克雷伯氏菌活菌和死菌的吸附能力進(jìn)行研究，如果活菌吸附能力高于死菌，可以從理論上分析兩者存在差異的原因；若死菌的吸附能力強(qiáng)于活菌，本研究不僅可以從理論上闡述死細(xì)胞和活細(xì)胞吸附能力差異的原理，更重要的是，具有致病性的克雷伯氏菌經(jīng)過(guò)高溫處理后失去活性，其對(duì)環(huán)境和人體都是一種安全的生物吸附劑，可以安全的應(yīng)用于實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用中。

本文使用從云南某礦山廢水中篩選得到的克雷伯氏菌，將發(fā)酵培養(yǎng)后直接離心收集的菌體作為活細(xì)胞吸附劑，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后再高溫處理收集的菌體作為死細(xì)胞吸附劑，在不同影響因素條件下（pH值、吸附劑用量、反應(yīng)時(shí)間和初始鉛濃度），對(duì)比了活細(xì)胞和死細(xì)胞對(duì)水中鉛的吸附能力。根據(jù)活細(xì)胞和死細(xì)胞的吸附動(dòng)力學(xué)、吸附等溫線、掃描電子顯微鏡（SEM）分析、比表面積分析、Zeta電位、傅里葉紅外光譜（FT?IR）和X射線光電子能譜（XPS）分析，闡述了克雷伯氏菌活細(xì)胞和死細(xì)胞對(duì)鉛去除性能的差異，為生物吸附劑去除重金屬的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥劑和儀器

實(shí)驗(yàn)藥劑：蔗糖，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，硫酸鎂，氯化鈉，尿素，氫氧化鈉，硫酸，硝酸鉛。所用藥品均為分析純。

實(shí)驗(yàn)儀器：分析天平（JA3003C，上海亨方科學(xué)儀器有限公司），pH計(jì)（PHSJ-5，上海雷磁儀器廠），恒溫培養(yǎng)振蕩器（SPH-1112D，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），高速冷凍離心機(jī)（GL-21M，賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-30SII，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司），智能真空干燥箱（DZF，上海丙林電子科技有限公司），原子吸收分光光度計(jì)（TAS-990AFG，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet iS5N，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司），Zeta電位分析儀（馬爾文nano ZS90，艾克賽普精密測(cè)控有限公司），掃描電子顯微鏡（JSM-7500F，上海百賀儀器科技有限公司），比表面積分析儀（JW-BK132F，北京精微高博科學(xué)技術(shù)有限公司），X射線光電子能譜分析儀（X′Pert?Powder，馬爾文帕納科公司）。

1.2 菌種來(lái)源

實(shí)驗(yàn)所用菌株取自云南某礦山廢水，使用常規(guī)的稀釋涂布和分離劃線法獲得的耐鉛細(xì)菌，經(jīng)16S rDNA序列分析鑒定為克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）。

1.3 實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基

菌株活化培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1.0 L，pH=7.0～7.2。

菌株發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖15.0 g，磷酸二氫鉀2.0 g，磷酸氫二鉀5.0 g，硫酸鎂0.2 g，氯化鈉0.1 g，尿素3.3 g，蒸餾水1.0 L，pH=6.0。

1.4 克雷伯氏菌活細(xì)胞和死細(xì)胞的制備

先將克雷伯氏菌在活化培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，按3%的接種量接種于液體培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)振蕩器中28℃、120 r·min-1的條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。將其中一部分發(fā)酵液進(jìn)行121℃、30 min高溫滅菌處理，然后離心（10 000 r·min-1、4 ℃）10 min后收集死菌體，作為死細(xì)胞吸附劑，命名為DC；另一部分菌體懸液直接使用離心機(jī)離心（10 000 r·min-1、4℃）10 min后，收集的菌體直接作為活細(xì)胞吸附劑，命名為L(zhǎng)C。上述死細(xì)胞和活細(xì)胞吸附劑在離心后均需再用無(wú)菌水洗滌2～3次后再離心收集，以去除表面殘留的培養(yǎng)基。收集到的死細(xì)胞和活細(xì)胞在80℃真空干燥箱中烘干后保存待用。

1.5 吸附試驗(yàn)

將100 mL不同初始濃度的鉛溶液加入到250 mL錐形瓶中，分別加入一定質(zhì)量的DC吸附劑和LC吸附劑，使用1 mol·L-1的HNO3和 1 mol·L-1的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH，放置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中，混合液在特定的轉(zhuǎn)速（150 r·min-1）、特定的溫度條件下反應(yīng)一定時(shí)間。在反應(yīng)達(dá)到平衡后，使用離心機(jī)，在10 000 r·min-1、4℃的條件下離心10 min，將上清液使用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定鉛離子濃度，并計(jì)算鉛的去除率及DC和LC對(duì)鉛的單位質(zhì)量吸附量，計(jì)算公式如下：

式中：R表示DC和LC對(duì)Pb（Ⅱ）的去除率，%；qe為DC和LC對(duì)Pb（Ⅱ）的單位質(zhì)量（干質(zhì)量）吸附量，mg·g-1；C0為初始Pb（Ⅱ）濃度，mg·L-1；Ce為吸附后溶液中剩余的Pb（Ⅱ）濃度，mg·L-1；V為實(shí)驗(yàn)使用的Pb（Ⅱ）溶液的體積，L；m為DC和LC的質(zhì)量（干質(zhì)量），g。所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次，最后結(jié)果取平均值。

1.6 特征分析

Zeta電位測(cè)定：分別稱一定量的DC和LC溶于水中，使其質(zhì)量濃度均為0.2 g·L-1（干質(zhì)量），使用1 mol·L-1的H2SO4和1 mol·L-1的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0，溶液混合均勻后，測(cè)定各個(gè)pH值下的Zeta電位。

SEM表征：使用日本JSM-7500F場(chǎng)發(fā)射電子顯微鏡對(duì)LC和DC的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，實(shí)驗(yàn)在20 kV的電壓下進(jìn)行。

LC和DC的比表面積和孔徑使用比表面積分析儀進(jìn)行測(cè)定，比表面積使用N2的吸附-解吸曲線進(jìn)行計(jì)算，孔徑使用Barrett-Joyner-Halenda（BJH）模型進(jìn)行測(cè)試。

FTIR表征：DC和LC兩種吸附劑及DC吸附Pb（Ⅱ）后的樣品（后面標(biāo)記為DC-Pb）中分別加入KBr，混合均勻后研磨，直至混合物粉末粘在瑪瑙研缽的壁上，然后，將混合物放入下壓芯中進(jìn)行壓片，壓片結(jié)束后，取出制作好的壓片放入到紅外光譜儀中測(cè)繪其紅外光譜。

XPS分析：在室溫下使用Al Kα X射線（hν=1 486.6 eV）單色束激發(fā)出光電子，所得到的結(jié)合能對(duì)應(yīng)的峰參考C1s在結(jié)合能為284.8 eV的峰。

2 結(jié)果與討論

2.1 DC和LC的表征分析

2.1.1 SEM分析

SEM分析是一種用于分析生物吸附劑表面形態(tài)的有用的技術(shù)方法。從圖1可以看出未經(jīng)處理的克雷伯氏菌LC（圖1a）和經(jīng)過(guò)高溫滅菌的克雷伯氏菌DC（圖1b）的表面形態(tài)存在很大的差異。LC成桿狀，細(xì)胞表面平滑、規(guī)則；DC的細(xì)胞完整性被破壞，細(xì)胞表面粗糙不規(guī)則并且具有大量的孔隙結(jié)構(gòu)，這些孔隙的形成有利于DC對(duì)水溶液中Pb（Ⅱ）的吸附。

圖1 LC和DC在SEM下的形貌特征Figure 1 SEM morphology of LC and DC

2.1.2 比表面積分析

DC和LC的N2吸附-解吸等溫曲線在-196.15℃條件下進(jìn)行，結(jié)果見(jiàn)圖2。根據(jù)國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）分類(lèi)，DC和LC的N2吸附-解吸曲線符合類(lèi)型Ⅳ等溫曲線，表明DC和LC的孔隙結(jié)構(gòu)主要是微孔和介孔[22]。DC和LC的比表面積分別為12.810 m2·g-1和 2.728 m2·g-1，平均孔徑分別為 10.150 nm和8.466 nm。因此，經(jīng)過(guò)滅菌處理的DC的比表面積和孔徑均明顯大于LC，表明DC在吸附過(guò)程中能夠提供更大的吸附表面，從而有利于對(duì)Pb（Ⅱ）的去除。該結(jié)果與SEM的結(jié)果相一致。

2.2 吸附試驗(yàn)

2.2.1 pH對(duì)吸附效果的影響

在100 mL 50 mg·L-1的Pb（Ⅱ）溶液中，分別加入0.02 g的DC吸附劑和LC吸附劑，并調(diào)節(jié)溶液pH值分別為1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和 6.0，混合液置于30℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中振蕩120 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3a。

圖2 DC和LC的N2吸附-解吸曲線Figure 2 N2adsorption-desorption isotherms of DC and LC

圖3 pH對(duì)DC和LC吸附Pb（Ⅱ）的影響（a）及DC和LC表面的Zeta電位（b）Figure 3 Effect of pH on the adsorption of DC and LC for Pb（Ⅱ）（a），and Zeta potential of DC and LC（b）

從圖3a可知，pH值對(duì)DC和LC吸附Pb（Ⅱ）有很大的影響。當(dāng)pH值從2.0增加到5.5，DC和LC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附量分別從10.78 mg·g-1和8.91 mg·g-1，增加到131.86 mg·g-1和104.83 mg·g-1。pH值的影響表明DC和LC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附主要是表面絡(luò)合作用。當(dāng)pH值低于3.0時(shí)，DC和LC兩種吸附劑表面的官能團(tuán)被質(zhì)子化，大量活性位點(diǎn)被H+占據(jù)，H+和帶正電的Pb（Ⅱ）對(duì)吸附位點(diǎn)存在競(jìng)爭(zhēng)，從而降低了吸附劑對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附[23]。當(dāng)pH值從3.0增大到6.0時(shí)，H+離開(kāi)吸附劑表面，吸附劑表面官能團(tuán)的質(zhì)子化作用逐漸降低，從而更有利于吸附劑表面官能團(tuán)對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附。在pH值為3.0～6.0時(shí)，DC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附量高于LC，從圖3b中DC和LC表面的Zeta電位分析可知，在此pH值范圍內(nèi)，DC比LC帶有更多的負(fù)電荷，從而加強(qiáng)了DC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附。

Reddy等[24]和He等[25]分別研究三維多孔尖晶石鐵氧體和β-環(huán)糊精結(jié)合石灰去除水溶液中的Pb2+時(shí)報(bào)道了水溶液中鉛的存在形態(tài)主要有Pb2+、Pb（OH）+、Pb（OH）2、Pb（、Pb（OH，各存在形態(tài)所占百分比隨溶液pH變化的關(guān)系如圖4所示。從圖4可知，當(dāng)pH值大于6.0時(shí)，有Pb（OH）+沉淀產(chǎn)生。在本研究的實(shí)驗(yàn)條件下，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，當(dāng)pH值大于6.0后，已經(jīng)有明顯的沉淀形成，難以判斷是沉淀作用還是吸附作用，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在pH 5.5的條件下進(jìn)行。

為了對(duì)比DC和LC兩種吸附劑在不同pH值條件下其表面所帶電荷的情況，采用Zeta電位進(jìn)行分析。膠體粒子分散在溶液中，其表面電荷產(chǎn)生了Zeta電位，它是描述膠粒表面電荷性質(zhì)的一個(gè)物理量，由于DC和LC表面存在大量的官能團(tuán)，當(dāng)這兩種吸附劑在溶液中分散時(shí)，細(xì)胞表面的官能團(tuán)發(fā)生電離，形成雙電層，進(jìn)而產(chǎn)生Zeta電位[26]。Zeta電位可以研究吸附劑表面所帶電荷量及電性隨pH值的變化，還可以對(duì)比兩種吸附劑表面電荷量和電性的差異以分析吸附劑在吸附過(guò)程中吸附行為的差異。

圖4 Pb2+的形態(tài)分布Figure 4 Speciation of Pb2+

在不同的pH值條件下，DC和LC的表面電荷變化見(jiàn)圖3b。隨著pH值的增加，DC和LC的Zeta電位降低，這是由于隨著pH值的增加，兩種吸附劑表面官能團(tuán)的質(zhì)子化作用減弱。DC和LC的等電點(diǎn)分別約為2.3和3.1，DC的等電點(diǎn)低于LC，說(shuō)明DC對(duì)正價(jià)的金屬離子具有更寬的吸附pH范圍。在pH低于2.3時(shí)，DC表面帶正電荷，會(huì)降低DC表面官能團(tuán)和Pb（Ⅱ）之間的靜電吸引作用從而使吸附效果受到影響。在pH值大于2.3后，DC比LC帶有更多的負(fù)電荷，可能是因?yàn)榻?jīng)過(guò)高溫滅菌處理后，DC表面暴露出更多的官能團(tuán)，能夠增加DC表面的電負(fù)性，從而有效提高DC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附量。該結(jié)果與pH值對(duì)吸附量的影響結(jié)果相一致。

2.2.2 吸附劑用量對(duì)吸附效果的影響

在一系列100 mL的50 mg·L-1的Pb（Ⅱ）溶液中，分別加入吸附劑DC和LC，使其質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 g·L-1（干質(zhì)量），調(diào)節(jié)溶液pH=5.5，在30℃的條件下振蕩120 min。DC和LC對(duì)Pb（Ⅱ）的去除率和吸附量結(jié)果如圖5所示。隨著DC和LC用量從0.1 g·L-1增加到0.8 g·L-1，DC和LC對(duì)Pb（Ⅱ）的去除率分別從32.45%和24.05%增加到97.31%和72.47%，這是因?yàn)槲轿稽c(diǎn)的數(shù)量隨著吸附劑添加量的增加而增加，從而使去除率提高。從圖5可知，DC和LC的用量增加到0.5 g·L-1后，DC和LC對(duì)溶液中Pb（Ⅱ）的去除率沒(méi)有明顯的增加，這可能是由于溶液中Pb（Ⅱ）的含量較低。與此同時(shí)，DC和LC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附量隨著吸附劑用量的增加而降低，這可能是吸附劑用量增加時(shí)造成了吸附劑的聚集，從而降低了有效的吸附面積，在吸附位點(diǎn)之間產(chǎn)生了干擾；當(dāng)吸附劑用量較高時(shí)，吸附劑表面可能會(huì)產(chǎn)生一種“屏蔽效應(yīng)”，從而降低了對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附[27]。為了避免這種“屏蔽效應(yīng)”，以及考慮使用成本和在相同條件下比較兩種吸附劑對(duì)Pb（Ⅱ）的去除效果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇DC和LC的用量均為0.2 g·L-1。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在不同的吸附劑用量條件下，DC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附效果明顯優(yōu)于LC。

圖5 DC和LC用量對(duì)吸附Pb（Ⅱ）的影響Figure 5 Effect of DC and LC dosage on the adsorption of Pb（Ⅱ）

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間的影響和吸附動(dòng)力學(xué)

吸附過(guò)程的動(dòng)力學(xué)研究主要是用來(lái)描述吸附劑對(duì)吸附質(zhì)的吸附速率。在初始Pb（Ⅱ）濃度為50 mg·L-1、溶液pH為5.5、吸附劑用量為0.2 g·L-1和反應(yīng)溫度為30℃的條件下，研究時(shí)間對(duì)DC和LC吸附Pb（Ⅱ）的影響及DC和LC的吸附動(dòng)力學(xué)行為。

時(shí)間對(duì)DC和LC吸附Pb（Ⅱ）的影響見(jiàn)圖6。隨著時(shí)間的增加，DC和LC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附量明顯增加，表明在吸附劑表面存在大量可用的活性位點(diǎn)，且Pb（Ⅱ）吸附到了吸附劑的表面。從圖6可知，DC和LC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附在60 min可達(dá)到吸附平衡，因此選擇60 min作為DC和LC后續(xù)實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)時(shí)間。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)DC和LC吸附Pb（Ⅱ）的影響及準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合結(jié)果Figure 6 Effect of contact time on adsorption of Pb（Ⅱ）by DC and LC and the fitting results using pseudo-first-order and pseudo-second-order models

微生物細(xì)胞的吸附一般分為兩個(gè)階段：快速吸附階段和緩慢達(dá)到平衡的慢速吸附階段。文獻(xiàn)中報(bào)道的有超過(guò)25種模型嘗試定量的描述吸附過(guò)程的動(dòng)力學(xué)行為，盡管各個(gè)模型都有其局限性，但是準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型已經(jīng)被成功應(yīng)用于對(duì)吸附數(shù)據(jù)的擬合[9]。準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型是基于假設(shè)吸附速率受擴(kuò)散步驟的控制，吸附速率與平衡吸附量和t時(shí)刻的吸附量的差值呈正比關(guān)系，主要用于通過(guò)邊界擴(kuò)散完成的單層吸附；準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型是假設(shè)吸附速率受化學(xué)吸附過(guò)程的控制，其涉及吸附劑與吸附質(zhì)之間存在共用電子或者電子轉(zhuǎn)移，吸附過(guò)程包含了外部液膜擴(kuò)散、表面吸附以及顆粒內(nèi)擴(kuò)散的復(fù)合吸附反應(yīng)，因此準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型能夠更全面地反映固-液之間的吸附動(dòng)力學(xué)行為[28-29]?；谖⑸锛?xì)胞本身組成的均勻性，以及其表面存在與重金屬離子相結(jié)合的羥基、羧基和氨基等基團(tuán)，這些基團(tuán)能與金屬離子之間發(fā)生物理化學(xué)反應(yīng)，因此準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型能夠?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，從而判定其吸附動(dòng)力學(xué)行為。準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型已經(jīng)被廣泛用于描述微生物吸附過(guò)程的動(dòng)力學(xué)行為，且多數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型[18，30-31]。

為了分析DC和LC吸附Pb（Ⅱ）的吸附動(dòng)力學(xué)行為，實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型（公式3）和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行擬合（公式4）[32]。

式中：qt是t（min）時(shí)間吸附劑對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附量，mg·g-1；k1和k2分別為準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的吸附速率常數(shù)，min-1和g·mg-1·min-1。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合見(jiàn)圖6和表1。

從表1可知，DC和LC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附結(jié)果表明，準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合的相關(guān)系數(shù)r2低于準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，因此，DC和LC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附更符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，說(shuō)明兩種吸附劑的吸附過(guò)程主要是化學(xué)吸附過(guò)程，化學(xué)吸附是速率控制步驟。

表1 DC和LC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters for the adsorption of DC and LC for Pb（Ⅱ）

2.2.4 初始濃度的影響和吸附等溫線

吸附等溫線的實(shí)驗(yàn)和之前的實(shí)驗(yàn)是一個(gè)相似的過(guò)程，配制100 mL初始濃度分別為10、20、30、40、50、75、100 mg·L-1的Pb（Ⅱ）溶液，分別加入DC和LC，吸附劑濃度為0.2 g·L-1，溶液pH=5.5，在30 ℃的條件下，反應(yīng)60 min，研究不同初始Pb（Ⅱ）濃度對(duì)DC和LC吸附效果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。在Pb（Ⅱ）濃度較低時(shí)，DC和LC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附量隨著初始Pb（Ⅱ）濃度的增加而明顯增加，表明初始Pb（Ⅱ）濃度在吸附過(guò)程中具有重要的作用，能夠在鉛離子之間產(chǎn)生驅(qū)動(dòng)力，從而降低溶液中的Pb（Ⅱ）和吸附劑上吸附的Pb（Ⅱ）之間的傳質(zhì)阻力，因此能夠加強(qiáng)Pb（Ⅱ）與吸附劑DC和LC之間的有效碰撞。當(dāng)溶液中的Pb（Ⅱ）濃度超過(guò)一定值后（本實(shí)驗(yàn)是50 mg·L-1），吸附量接近一個(gè)常數(shù)，這可能是因?yàn)槲絼┍砻娴奈轿稽c(diǎn)達(dá)到吸附飽和。

為了更充分地描述DC和LC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Langmuir模型（公式5）和 Freun?dlich（公式6）模型進(jìn)行擬合[33]。

式中：qmax是預(yù)測(cè)的吸附劑對(duì)Pb（Ⅱ）的最大吸附量，mg·g-1；KL是Langmuir常數(shù)，L·mg-1；KF是Freundlich常數(shù)；1/n是經(jīng)驗(yàn)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合結(jié)果見(jiàn)圖7和表2。

從表2中的結(jié)果可知，Langmuir模型擬合的相關(guān)系數(shù)r2明顯大于Freundlich模型，說(shuō)明DC和LC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附結(jié)果更符合Langmuir模型，吸附過(guò)程為單分子層吸附。Langmuir模型由預(yù)測(cè)的最大吸附量（qmax）和常數(shù)KL決定，DC和LC的qmax分別為134.92 mg·g-1和 116.18 mg·g-1，且 DC的 KL（0.887 2）明顯大于LC（0.266 9），從qmax和KL的對(duì)比可知，DC比LC具有更強(qiáng)的吸附Pb（Ⅱ）的能力。Freundlich模型的特征由KF和n決定，KF和n值越大說(shuō)明吸附劑與金屬的親和力越強(qiáng)。從Freundlich模型擬合的結(jié)果可知，DC的KF和n值明顯大于LC，說(shuō)明DC與Pb（Ⅱ）的結(jié)合能力高于LC，因此DC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附量高于LC。

2.2.5 溫度的影響和吸附熱力學(xué)計(jì)算

圖7 吸附等溫線及Langmuir和Freundlich模型擬合Figure 7 Adsorption isotherms and the fitting results by Langmuir and Freundlich models

表2 Langmuir和Freundlich模型擬合結(jié)果Table 2 Fitting results of adsorption isotherms based upon Langmuir and Freundlich models

配制100 mL初始濃度為50 mg·L-1的Pb（Ⅱ）溶液，分別加入DC和LC，吸附劑濃度為0.2 g·L-1，調(diào)節(jié)溶液pH為5.5，在溫度分別為25、30、35、40℃的條件下，反應(yīng)60 min，研究溫度對(duì)DC和LC吸附效果的影響。根據(jù)DC和LC在不同溫度下對(duì)Pb（Ⅱ）吸附平衡數(shù)據(jù)，計(jì)算吸附過(guò)程中的熱力學(xué)參數(shù)如吉布斯自由能變?chǔ)、焓變?chǔ)和熵變?chǔ)，具體計(jì)算過(guò)程如下：

式中：N為理想氣體常數(shù)8.314 J·mol-1·K-1；T為溫度，K；Kd為在溫度T時(shí)的平衡常數(shù)。使用lnKd對(duì)1/T作圖擬合，焓變?chǔ)和熵變?chǔ)可以使用所得線性圖的斜率和截距計(jì)算。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8和表3。

從表3可知，DC和LC在不同溫度下吸附Pb（Ⅱ）的ΔG均為負(fù)數(shù)，表明DC和LC吸附水溶液中Pb（Ⅱ）均是自發(fā)進(jìn)行的。對(duì)于DC吸附Pb（Ⅱ），ΔG的絕對(duì)值隨著溫度增加而減小，表明吸附的自發(fā)能力越?。磺姚為-15.26 kJ·mol-1，ΔH為負(fù)值表明DC吸附Pb（Ⅱ）是一個(gè)放熱過(guò)程，溫度升高不利于吸附過(guò)程的進(jìn)行；ΔS＜0，說(shuō)明DC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附過(guò)程為熵減的過(guò)程，吸附過(guò)程的隨機(jī)性減小。此結(jié)果與吳涓等[34]研究滅活的黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysospori?um）對(duì)鉛的吸附為自發(fā)放熱的過(guò)程一致。對(duì)于LC吸附Pb（Ⅱ），其表現(xiàn)出與DC相反的結(jié)果，ΔG的絕對(duì)值隨著溫度增加而增加，吸附的自發(fā)能力也就越大；ΔH＞0和ΔS＞0，表明LC吸附Pb（Ⅱ）是吸熱過(guò)程且吸附過(guò)程中固液界面的隨機(jī)性增加。

表3 DC和LC吸附Pb（Ⅱ）的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters for the adsorption of Pb2+by DC and LC

2.3 吸附機(jī)理分析

2.3.1 FTIR分析

圖8 lnKd對(duì)1/T繪圖Figure 8 Plot of lnKdversus 1/T

圖9 LC和DC吸附Pb（Ⅱ）前及DC吸附Pb（Ⅱ）后的紅外光譜Figure 9 FTIR spectra of before adsorption of LC and DC for Pb（Ⅱ）and after adsorption of Pb（Ⅱ）by DC

FTIR是一種分析吸附劑表面官能團(tuán)組成的有效手段。圖9展示了LC和DC吸附Pb（Ⅱ）前及DC吸附Pb（Ⅱ）后（DC-Pb）的FTIR光譜。從圖9 LC吸附Pb（Ⅱ）前的FTIR光譜可知，3467 cm-1和2923 cm-1分別為-OH/-NH2重疊峰和C-H的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，該區(qū)域出現(xiàn)的峰為糖類(lèi)典型的特征峰[19]；1670 cm-1由酰胺Ⅰ帶中C=O和C-N伸縮產(chǎn)生，1549 cm-1為酰胺Ⅱ帶中C-N伸縮及N-H彎曲振動(dòng)產(chǎn)生，1245 cm-1屬于酰胺Ⅲ帶中C-N伸縮產(chǎn)生的吸收峰，以上特征峰表明克雷伯氏菌活細(xì)胞中存在蛋白質(zhì)；1421 cm-1為-COOH對(duì)稱伸縮的吸收峰，1083 cm-1為糖環(huán)中乙醇的C-O伸縮[18]；721～964 cm-1為磷脂質(zhì)或磷酸核糖基焦磷酸鏈中P-O-C和P-O-P伸縮振動(dòng)[15]。由上述特征峰分析可知，克雷伯氏菌活細(xì)胞的主要成分為多糖、蛋白質(zhì)和磷脂，含有羥基、氨基、羧基及磷酸基。對(duì)比LC和DC的FTIR光譜，可知在經(jīng)過(guò)高溫滅菌后，失活的死細(xì)胞和活細(xì)胞的紅外光譜有明顯的不同。DC的-OH/-NH2重疊峰的峰位置發(fā)生變化及C-H峰強(qiáng)變?nèi)酰货０发駧Ш王０发驇У姆迕黠@增強(qiáng)；-COOH和糖環(huán)中乙醇C-O的峰強(qiáng)變?nèi)跚曳逦恢冒l(fā)生了偏移；721～964 cm-1吸收峰消失。上述變化表明，經(jīng)過(guò)高溫處理后克雷伯氏菌細(xì)胞組成成分多糖、蛋白質(zhì)及磷脂受到了影響，但是酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶明顯增強(qiáng)，表明暴露出了更多的氨基。DC吸附后，在574 cm-1出現(xiàn)一個(gè)新峰，表明Pb（Ⅱ）已成功被DC吸附。羥基、氨基和羧基的特征峰峰位置均發(fā)生了偏移或峰強(qiáng)減弱，說(shuō)明它們均參與了DC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附過(guò)程，通過(guò)絡(luò)合配位、靜電作用和化學(xué)吸附反應(yīng)等作用去除Pb（Ⅱ）。但是DC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附效果明顯提高，可能是因?yàn)楦喟被谋┞逗?21～964 cm-1吸收峰消失。氨基基團(tuán)的增多，使DC和Pb（Ⅱ）之間的絡(luò)合配位及靜電作用增強(qiáng)；721～964 cm-1吸收峰消失，表明經(jīng)過(guò)高溫處理后，細(xì)胞壁不再完整，因此死細(xì)胞的細(xì)胞壁的滲透性增強(qiáng)使重金屬能夠更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從而提高了吸附能力。

2.3.2 XPS分析

圖10 LC、DC和DC-Pb的XPS全譜圖Figure 10 XPS spectrum of LC，DC and DC-Pb

圖11 LC、DC和DC-Pb的N1s及O1s的XPS譜圖Figure 11 XPS spectra of N1s and O1s for the LC，DC and DC-Pb

使用X射線光電子能譜技術(shù)，對(duì)比LC、DC和DC吸附Pb（Ⅱ）后的樣品（DC-Pb）之間的差異，結(jié)果見(jiàn)圖10和圖11。從圖10 LC、DC和DC-Pb全譜圖可知，DC在吸附Pb（Ⅱ）后，有明顯的元素Pb的峰產(chǎn)生，表明Pb（Ⅱ）確實(shí)吸附到了DC的表面。為了進(jìn)一步分析DC和LC的不同以及DC吸附Pb（Ⅱ）起主要作用的基團(tuán)，對(duì)N1s和O1s的峰進(jìn)行分峰擬合，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示。對(duì)于N1s，LC僅在399.41 eV處擬合出NH2的一個(gè)峰，而DC在400.72、400.10 eV和399.30 eV處分別擬合出NH+3、N-C=O和NH2對(duì)應(yīng)的峰[35]。說(shuō)明經(jīng)過(guò)高溫滅菌處理后，有更多的氨基基團(tuán)暴露出來(lái)，此結(jié)果與FTIR的分析結(jié)果一致。而DC在吸附Pb（Ⅱ）后，可以看出氨基基團(tuán)的峰位置及峰面積比均發(fā)生了變化，N-C=O和NH2的峰面積比分別由吸附前的41.17%和38.67%降低至37.42%和33.12%，說(shuō)明氨基基團(tuán)參與了吸附過(guò)程。對(duì)比LC、DC和DC-Pb的O1s的分峰擬合結(jié)果可知，LC在533.16、532.51、531.62 eV和530.75 eV處分別擬合出O-P、C-O、O=CO和O=C-NH2的峰[36-37]。DC中O-P和O=C-O的峰面積比低于LC，但C-O和O=C-NH2的峰面積比增加，表明高溫處理破壞了克雷伯氏菌細(xì)胞壁的完整性，使其他基團(tuán)更多的暴露出來(lái)。在DC吸附Pb（Ⅱ）后，CO、O=C-O和O=C-NH2的結(jié)合能和峰面積比均比吸附前明顯減少，表面含氧的羥基、羧基和氨基參與了反應(yīng)。羥基、羧基和氨基可以通過(guò)離子交換、表面絡(luò)合和靜電吸引等作用結(jié)合重金屬離子[38]。對(duì)于含有氨基的基團(tuán)，吸附后變化最為明顯，說(shuō)明氨基基團(tuán)在吸附過(guò)程中的貢獻(xiàn)最大。

3 結(jié)論

（1）克雷伯氏菌死細(xì)胞（DC）和活細(xì)胞（LC）均能夠有效去除水中的Pb（Ⅱ），在各實(shí)驗(yàn)條件下，DC對(duì)Pb（Ⅱ）的吸附量明顯高于LC。

（2）SEM和比表面積分析可知，DC比LC具有更大的比表面積，是由于高溫處理破壞了細(xì)胞的完整性且增加了細(xì)胞的通透性；Zeta電位分析表明在不同pH值條件下，在等電點(diǎn)之后DC比LC帶有更多的負(fù)電荷，從而利于DC細(xì)胞與金屬離子之間通過(guò)靜電作用結(jié)合。

（3）利用FTIR和XPS分析表明，經(jīng)過(guò)高溫處理過(guò)的DC表面暴露出更多的氨基基團(tuán)，從而對(duì)Pb（Ⅱ）具有更強(qiáng)的結(jié)合能力；DC中吸附Pb（Ⅱ）的官能團(tuán)有羥基、羧基和氨基，其中氨基起主要作用。

（4）本研究選用的克雷伯氏菌是一種具有致病性的微生物。但是從本研究的結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)中選用的克雷伯氏菌經(jīng)過(guò)高溫滅活后無(wú)毒的死細(xì)胞比活細(xì)胞對(duì)Pb（Ⅱ）具有更高的吸附能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果一方面為克雷伯氏菌在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中提供了理論指導(dǎo)，另一方面表明克雷伯氏菌經(jīng)過(guò)高溫處理失去活性后為一種綠色、環(huán)保的生物吸附劑，大幅提高了其在處理含重金屬?gòu)U水的過(guò)程中的利用潛力及實(shí)際應(yīng)用的意義。