向 蓉，翟少倫，王曉虎，陳 晶，黃 元，黃 忠，向 華

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

羊口瘡，又稱(chēng)羊傳染性膿皰，是由羊口瘡病毒（Orf virusk, ORFV）引起的綿羊和山羊的一種接觸性傳染病，具有嗜上皮性，以口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水皰、膿皰和結(jié)成疣狀結(jié)痂為特征。ORFV屬于痘病毒科副痘病毒屬，是一種人獸共患病原，羔羊?qū)ζ渥顬槊舾校昱?、鹿和人也可感染?］。羊口瘡最早發(fā)現(xiàn)于歐洲，現(xiàn)已廣泛分布于全世界［2］。我國(guó)也越來(lái)越常見(jiàn)該病的報(bào)道，新疆、甘肅、青海、內(nèi)蒙古及東北三省主要養(yǎng)羊地區(qū)均有該病發(fā)生和流行［3-8］。隨著養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展以及羊只引種等交易頻繁，廣東省也陸續(xù)有羊口瘡的發(fā)病報(bào)道［9-10］。羊口瘡傳染性強(qiáng)，流行迅速，一只羊患病即可感染全群，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此對(duì)該病及早診斷和治療尤為重要。羊口瘡病變特異，初步診斷不難，但要確診還需進(jìn)一步診斷。目前已建立不同類(lèi)型的PCR檢測(cè)方法，擴(kuò)增的靶基因主要是B2L囊膜蛋白基因等。ORFV基因組中，BamH I酶切片段的B2L基因是一個(gè)完整的閱讀框，又稱(chēng)為ORFV011，蛋白編碼蛋白質(zhì)大小為42 ku。該蛋白是病毒囊膜蛋白，可刺激淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)，B2L基因在ORFV中相對(duì)保守，能夠刺激淋巴細(xì)胞增殖，引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，是ORFV重要的保護(hù)性抗原［11-13］。

2016年6月，廣東省清遠(yuǎn)市某羊場(chǎng)的羊只疑似發(fā)病，本課題組赴羊場(chǎng)采樣，發(fā)現(xiàn)病羊在口唇和舌頭處發(fā)生潰瘍、生瘡，有的已形成痂皮或疣狀病變（桑葚狀痂垢），發(fā)病率較高，但死亡率低。根據(jù)臨床特征、病理變化和PCR檢測(cè)，診斷為羊口瘡。為了獲得致病毒株，本試驗(yàn)對(duì)病毒進(jìn)行了系統(tǒng)的分離鑒定，并對(duì)該病毒的B2L基因與其他毒株的序列進(jìn)行比對(duì)分析和遺傳進(jìn)化分析，以期了解廣東地區(qū)ORFV流行毒株的基因分子特征，以及與其他毒株的親緣關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

陽(yáng)性對(duì)照為購(gòu)自山東泰豐的疫苗毒。MDBK細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存，病料為廣東省清遠(yuǎn)市某羊場(chǎng)疑似羊口瘡發(fā)病山羊的唇部痂皮。

主要試劑和儀器：Premix TaqTM、100 bp NDA Ladder（Dye Plus）、DNA Marker DL2000、pMD-18T載體等購(gòu)自TaKaRa公司，病毒RNA/DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自美基生物科技有限公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品，凝膠成像分析系統(tǒng)（Tanon 1600）為上海天能科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病料處理 將采回的病羊痂皮病料用無(wú)菌剪刀剪成適宜大小，無(wú)菌1×PBS緩沖液反復(fù)漂洗3次，完全剪碎后加PBS緩沖液進(jìn)行研磨，研磨液制成1∶10的懸液，加青霉素、鏈霉素各2 000單位/mL，-20℃反復(fù)凍融3次，然后4℃浸毒過(guò)夜，3 000 r/min離心30 min，取上清液，再用孔徑0.45 μm的濾器過(guò)濾，備用。

1.2.2 病毒分離和培養(yǎng) MDBK細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)至狀態(tài)良好，待細(xì)胞鋪滿細(xì)胞瓶單層，用1×PBS緩沖液清洗細(xì)胞2～3次，棄掉緩沖液。接種1.2.1中處理好的病毒液1 mL，37℃ CO2培養(yǎng)箱中感作1 h，棄去病毒液，1×PBS緩沖液清洗細(xì)胞1～2次，再加入含2%FBS的DMEM維持液37℃繼續(xù)培養(yǎng)，此后每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞病變情況，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。當(dāng)出現(xiàn)80%細(xì)胞病變時(shí)收毒，-20℃凍融3次，收集病毒液，同時(shí)繼續(xù)傳代。若細(xì)胞在接種病料后5 d內(nèi)未出現(xiàn)病變則連續(xù)盲傳3代，若第5代仍未病變視為陰性。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)［14］針對(duì)羊口瘡病毒的免疫囊膜蛋白B2L基因設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，由Invitrogen公司合成。

上游引物 B2L（UP）：5' ATG TGG CCG TTC TCC TC 3'

下游引物 B2L（DN）：5' TTA ATT TAT TGG TTT GCA GAA CT 3'

1.2.4 病毒PCR鑒定 按照病毒RNA/DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，從疫苗毒、病料痂皮和第1～6代傳代細(xì)胞病毒液中提取DNA。以提取的病毒基因組DNA為模板擴(kuò)增目的片段，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2×Premix TaqTM25 μL、B2L上下游引物各2 μL、DNA模板6 μL、ddH2O 15 μL，反應(yīng)條件為 94℃ 5 min；94℃ 30 s、53℃30 s、72℃90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。取6 μL PCR產(chǎn)物在8 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果并拍照。

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收后與pMD-18T載體連接，挑取陽(yáng)性克隆送Invitrogen公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，同時(shí)應(yīng)用DNA Star軟件的MegAlign對(duì)分離株B2L基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括將獲得毒株的B2L基因核苷酸序列和NCBI中其他羊口瘡毒株B2L基因進(jìn)行多序列比對(duì)以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)等。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離及培養(yǎng)

病料懸液接種MDBK細(xì)胞后第1代未出現(xiàn)病變，72 h時(shí)收毒并盲傳第2代，從第2代開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變，病變時(shí)間出現(xiàn)在48 h左右，繼續(xù)傳到第6代時(shí)細(xì)胞病變時(shí)間變得規(guī)律，細(xì)胞病變時(shí)間出現(xiàn)在40 h左右，細(xì)胞病變表現(xiàn)為：胞核濃縮、變圓、團(tuán)聚、拉網(wǎng)、最后脫落，對(duì)照細(xì)胞表現(xiàn)正常（圖1）。繼續(xù)傳代至第12代，且隨著傳代次數(shù)的增加出現(xiàn)細(xì)胞病變也更加規(guī)律，將該病毒分離株命名為ORFV/GD-QY/01。

圖1 MDBK細(xì)胞接種前后表現(xiàn)

2.2 PCR檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果

以疫苗毒陽(yáng)性對(duì)照、原病料痂皮和分離毒第1～6代病毒液分別提取的病毒基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖2）顯示，擴(kuò)增出1 137 bp左右的目的基因片段，與預(yù)期片段長(zhǎng)度相符。目的片段測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖3，序列經(jīng)BLAST核酸序列搜索后，顯示與測(cè)序序列相似性高的均為ORFV核酸序列，說(shuō)明分離病毒為ORFV。

圖2 痂皮及細(xì)胞毒中B2L基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 ORFV/GD-QY/01的B2L基因全序列

2.3 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建結(jié)果

從NCBI中下載國(guó)內(nèi)外發(fā)布的ORFV不同毒株B2L基因序列，與分離株ORFV/GD-QY/01的B2L基因序列進(jìn)行比較分析，利用DNAStar軟件計(jì)算遺傳距離，根據(jù)遺傳距離繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。遺傳進(jìn)化樹(shù)（圖4）結(jié)果顯示，ORFV/GD-QY/01分離株與臺(tái)灣分離毒株（EU935106、DQ904351）的親緣關(guān)系最近，處于同一分支上。

3 結(jié)論與討論

圖4 B2L基因系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)

ORFV的B2L基因序列高度保守，有文獻(xiàn)報(bào)道，不同來(lái)源的羊口瘡病毒B2L基因僅有個(gè)別堿基的差別。因此，保守的B2L基因常用于鑒定該病毒。本研究根據(jù)病羊表現(xiàn)的典型臨床癥狀初步診斷為羊口瘡，為確診病原，針對(duì)B2L基因設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。病料痂皮樣本的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，產(chǎn)物條帶與預(yù)期目的基因大小一致，測(cè)序結(jié)果也證實(shí)序列為ORFV的B2L基因，因此可以確定病料中含有羊口瘡病毒。將病料研磨上清液接種MDBK細(xì)胞，從第2代開(kāi)始出現(xiàn)典型的CPE，一直傳代到第12代，一直存在規(guī)律的CPE。第1～6代的細(xì)胞毒同時(shí)進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增條帶均與預(yù)期目的基因大小一致，經(jīng)測(cè)序鑒定為ORFV的B2L基因，表明從清遠(yuǎn)羊場(chǎng)病羊痂皮中分離獲得1株羊口瘡病病毒（ORFV/GD-QY/01）。

B2L基因產(chǎn)物經(jīng)回收測(cè)序后，將測(cè)序結(jié)果與國(guó)內(nèi)外發(fā)表的ORFV不同毒株相應(yīng)的核苷酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果表明ORFV/GDQY/01株B2L基因與臺(tái)灣山羊分離株（DQ904351和EU935106）親緣關(guān)系最近，相似性為99.2%，其次是國(guó)內(nèi)福建株和陜西株等，分別為99.0%和98.4%，與國(guó)外如北美和拉丁美洲等的分離株的同源性較低，低于93.0%。這表明B2L基因雖然高度保守，但隨著空間距離的擴(kuò)大，在遺傳上仍存在一定差異，可能是由于病毒在不同地域環(huán)境下進(jìn)化過(guò)程中的變異所致。

廣東省養(yǎng)羊規(guī)模逐漸壯大，尤其政府對(duì)牛羊養(yǎng)殖的鼓勵(lì)政策刺激了養(yǎng)羊業(yè)的蓬勃發(fā)展，但目前依然存在肉羊上市量滿足不了市場(chǎng)需求的現(xiàn)狀［15］，其中一個(gè)重要原因就是各種羊病頻發(fā)，以及缺乏對(duì)疾病防治的技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)。羊口瘡是一種人獸共患病，其病原體具有高度的嗜上皮性，引起感染部位皮膚以及粘膜增生性病變。目前，對(duì)該病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但各國(guó)已經(jīng)使用分子生物學(xué)的方法進(jìn)行疾病診斷，并加緊進(jìn)行病毒分子生物學(xué)研究和基因工程苗研究［16-17］。本研究利用MDBK細(xì)胞從發(fā)病羊場(chǎng)成功分離到一株羊口瘡病毒，為今后進(jìn)一步研制羊口瘡疫苗和檢測(cè)試劑打下了良好的基礎(chǔ)，進(jìn)而為該病的防控提供了技術(shù)保障。