唐愈菲

(1.邵陽學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，湖南 邵陽,422000； 2.邵陽學(xué)院 分子生物學(xué)診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 邵陽，422000)

肺炎支原體是在1944年首次分離并培養(yǎng)的一種柔膜綱、支原體科微生物。Mp經(jīng)常感染嬰幼兒以及老年人等體弱患者。它是引發(fā)社區(qū)獲得性肺炎的主要致病微生物之一?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)肺炎支原體感染還可能導(dǎo)致腦炎、心肌炎、腎炎以及溶血性貧血等多種并發(fā)癥[1-2]。由于有許多無癥狀或癥狀較輕的肺炎支原體患者，他們經(jīng)常極少去尋求治療，導(dǎo)致肺炎支原體的患病率普遍被低估。支原體是目前已知最小的能夠自我復(fù)制的生命形式，但是對支原體的致病機(jī)制并沒有完全研究清楚。

鐵元素是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)一種非常重要的過渡金屬，它參與了病原菌的DNA合成、RNA合成、電子傳遞以及運(yùn)輸氧等多種生理及生化過程，是病原菌生長和致病過程中必不可少的一種金屬元素。但是如果細(xì)菌內(nèi)鐵離子濃度過高，會引起病原菌內(nèi)的氧化失調(diào)，對病原菌造成損傷。細(xì)菌能夠感知鐵離子的含量，并改變一系列基因的表達(dá)來維持體內(nèi)鐵離子的平衡。實(shí)驗(yàn)證實(shí)鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白參與了調(diào)控細(xì)菌體內(nèi)鐵離子的濃度，此外Fur蛋白還參與了病原菌的致病作用[3]。由于支原體的基因數(shù)量極少，限制了它從環(huán)境中獲得營養(yǎng)需求的功能[4]。到目前為止還不知道支原體是通過何種機(jī)制從環(huán)境中獲得鐵離子，本研究通過生物信息學(xué)分析肺炎支原體Fur蛋白的各種生物學(xué)性質(zhì)，為研究Fur蛋白在肺炎支原體中的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Fur蛋白的序列從NCBI中獲得(GenBank:BAV20560.1)。

1.2 研究方法

Fur蛋白的結(jié)構(gòu)域使用NCBI在線軟件分析；Fur蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)使用Protparam軟件分析；Fur蛋白的親水性和疏水性使用ProtScale預(yù)測(Kyte—Doolittle模型)[5]；使用SignalP 4.1軟件預(yù)測Fur蛋白是否含有信號肽[6]；使用PSORT軟件預(yù)測Fur蛋白的定位[7]；Fur蛋白的二級結(jié)構(gòu)使用Sopma軟件進(jìn)行預(yù)測[8]；Fur蛋白的三級結(jié)構(gòu)使用Swiss-model軟件進(jìn)行預(yù)測[9]；Fur蛋白的B細(xì)胞表位使用Abcpred軟件進(jìn)行預(yù)測[10]。

2 結(jié)果

2.1 肺炎支原體Fur蛋白的結(jié)構(gòu)域

采用NCBI中數(shù)據(jù)庫分析肺炎支原體Fur蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，使用Blast搜索得到的結(jié)果如圖1，發(fā)現(xiàn)目的蛋白具有Fur蛋白結(jié)構(gòu)域，還具有DNA結(jié)合位點(diǎn)，證實(shí)目的蛋白是一個Fur蛋白。

圖1 肺炎支原體Fur蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Conservative domain analysis of Fur protein of MP

利用Protparam分析Fur蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果可知它的理論分子量為18.9kDa，理論pI值是9.02。它的不穩(wěn)定系數(shù)為30.66，比閾值40小，因此為比較穩(wěn)定蛋白。平均親水性系數(shù)為-0.561，故Fur蛋白為親水性蛋白。

2.2 分析肺炎支原體Fur蛋白的親疏水性

采用ProtScale軟件中的Kyte—Doolittle算法預(yù)測Fur蛋白的親疏水性質(zhì)。預(yù)測結(jié)果如圖2所示，其中得分為負(fù)值的為親水性區(qū)域，正值部分是疏水性區(qū)域。其中37-44，72-89，129-132，145-152位氨基酸可能為疏水性區(qū)域，其他部分的氨基酸為親水性區(qū)域，F(xiàn)ur蛋白總體呈親水性，與Protparam軟件的分析結(jié)果一致。

圖2 使用ProtScale預(yù)測肺炎支原體Fur蛋白的親疏水性Fig.2 Hydrophilic and hydrophobic prediction of MP Fur protein

2.3 Fur蛋白的定位

通過SignalP 4.1軟件預(yù)測得知肺炎支原體Fur蛋白無信號肽，可能定位在支原體的細(xì)胞質(zhì)(見圖3)，與使用PSORT軟件預(yù)測的結(jié)果相符合，定位在細(xì)胞質(zhì)。

圖3 使用SignalP 4.1軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)肺炎支原體Fur蛋白無信號肽Fig.3 The signal peptide prediction of MP Fur protein

2.4 肺炎支原體 Fur蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用Sopma軟件預(yù)測肺炎支原體Fur蛋白的二級結(jié)構(gòu)，預(yù)測發(fā)現(xiàn)Fur蛋白的α螺旋含量最高，占47.5%，無規(guī)卷曲占36.7%，β片層占12.7%(見圖4)。

圖4 利用Sopma軟件預(yù)測肺炎支原體Fur蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.4 The secondary structure of MP Fur protein was analyzed by Sopma

2.5 肺炎支原體Fur蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用Swiss-model軟件模擬Fur蛋白的三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)支原體的Fur蛋白與鏈球菌的Fur蛋白(PDB：4lmy.1.B)具有非常類似的結(jié)構(gòu)，用鏈球菌的Fur蛋白為模板進(jìn)行模擬，得到肺炎支原體的結(jié)構(gòu)如圖5所示，由兩個Fur蛋白組成的同源二聚體。

圖5 利用Swiss-model軟件預(yù)測肺炎支原體Fur蛋白的三級結(jié)構(gòu)Fig.5 The 3D structure of MP Fur protein was constructed by Swiss-model

2.6 預(yù)測肺炎支原體Fur蛋白的B細(xì)胞表位

利用Abcpred在線軟件預(yù)測肺炎支原體Fur的B細(xì)胞表位，其中得分為0.70以上的為可能的B細(xì)胞表位，預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fur蛋白可能的B表位有8條多肽(見表1)，證明Fur具有非常好的免疫原性。

3 討論

臨床上肺炎支原體感染導(dǎo)致的肺炎患者越來越多，目前發(fā)現(xiàn)肺炎支原體能從多個方面對宿主造成損傷。目前已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)肺炎支原體使用粘附素蛋白與宿主粘膜上皮細(xì)胞發(fā)生相互作用，直接破壞宿主細(xì)胞。肺炎支原體的CARDS毒素在致病過程中起重要功能，研究證實(shí)ADP-核糖基化活性與它的N端有關(guān)，它的C端具有空泡活性和受體結(jié)合功能[11]。肺炎支原體能夠引起宿主的免疫功能混亂從而致病。調(diào)查發(fā)現(xiàn)臨床分離得到的肺炎支原體耐藥率也不斷升高，治療肺炎支原體感染變得愈發(fā)困難[1-2]。肺炎支原體致病的前提是能夠在患者體內(nèi)獲得足夠多的營養(yǎng)物質(zhì)，但是肺炎支原體調(diào)控獲取鐵元素的機(jī)制尚無研究。

鐵是細(xì)菌體內(nèi)重要的金屬元素之一，在細(xì)菌的生長，代謝和致病中都起到極為重要功能。病原菌在進(jìn)化過程中形成了多種鐵攝取系統(tǒng)?？墒侨绻F含量過高，會通過Fenton反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)含量增高，從而破壞細(xì)菌的DNA、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，會引發(fā)對細(xì)菌的毒性。故必須嚴(yán)格調(diào)控病原菌細(xì)胞內(nèi)鐵平衡。研究證實(shí)病原菌是通過Fur蛋白控制鐵的含量。Fur是廣泛存在在細(xì)菌內(nèi)的一種負(fù)向調(diào)控因子，當(dāng)細(xì)菌體內(nèi)鐵元素過多時候，F(xiàn)ur蛋白與鐵結(jié)合，抑制細(xì)菌攝入鐵元素。當(dāng)細(xì)菌體內(nèi)鐵元素含量過低時，F(xiàn)ur與鐵解離，從而開始攝入大量的鐵元素[3]。Fur蛋白需要Fe2+作為共同的輔助因子，所以可以使用Fe2+來控制Fur蛋白的活性。Fur蛋白通過調(diào)控過氧化氫酶和超氧化物歧化酶等多種酶物質(zhì)的表達(dá)來抵抗氧化脅迫，F(xiàn)ur能夠調(diào)控多種毒力蛋白的表達(dá)和糖代謝等多種生理生化途徑[3,12-13]。此外，F(xiàn)ur蛋白可以控制病原菌中鋅和錳等重金屬的攝取[3]。肺炎支原體的基因組中具有一個Fur蛋白，在前期的研究中克隆獲得了肺炎支原體Fur蛋白，并通過基因工程的方法純化得到了Fur蛋白，但是它的生物學(xué)特性并不完全清楚[14]。文中使用生物信息學(xué)方法分析了肺炎支原體Fur蛋白的分子量、定位、親疏水性、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)等生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)肺炎支原體Fur蛋白與鏈球菌的Fur蛋白結(jié)構(gòu)非常類似，故預(yù)測它與鏈球菌Fur蛋白具有類似的功能，能夠上調(diào)抗氧化蛋白的表達(dá)，起抗氧化功能[15]。應(yīng)進(jìn)一步使用基因敲除等方法，將肺炎支原體中的Fur蛋白敲除，檢測突變株肺炎支原體在氧化應(yīng)激下的生長情況，進(jìn)一步研究Fur蛋白在肺炎支原體中的功能。