閆毅鳳，譚志鵬，劉海瓊，王思懿，陳愛華

流行病學(xué)研究表明，心血管并發(fā)癥是當(dāng)前糖尿病患者的首要死亡原因[1-2]。糖尿病作為一種終身代謝性疾病，其長期慢性高血糖可損傷心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致動脈粥樣硬化和高血壓病[3]，還可誘發(fā)糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)。DCM將導(dǎo)致心肌組織的廣泛病灶性壞死，增加心律失常、心力衰竭、心源性休克甚至猝死的發(fā)生風(fēng)險。DCM的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及心肌代謝障礙、氧化應(yīng)激、鈣調(diào)節(jié)異常、線粒體解偶聯(lián)等多個方面[4]。葡萄糖清除率降低和肝葡萄糖擴(kuò)增也可能是其發(fā)病原因之一[5]。但目前還沒有任何具體機(jī)制或特效藥物可解釋或治療DCM。

1986年，Murry等[6]發(fā)現(xiàn)反復(fù)短暫的心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)預(yù)處理能夠減輕心肌缺血性損傷。因?yàn)槿毖A(yù)適應(yīng)能夠激發(fā)應(yīng)激機(jī)制，產(chǎn)生并釋放心臟的內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)如腺苷、緩激肽、一氧化氮等，最終減輕更長時間的缺血缺氧性損傷，增強(qiáng)心肌對缺血缺氧的耐受力[7-8]。2015年，Wei等[9]提出了心肌肥厚預(yù)適應(yīng)的概念，即心肌肥厚預(yù)處理能夠抑制誘導(dǎo)心肌肥厚的calcineurin/NFAT信號通路，增強(qiáng)小鼠心臟的抗心肌肥厚能力，抑制心臟重構(gòu)，延緩心衰進(jìn)程并改善心功能。缺血預(yù)處理和肥厚預(yù)處理可在心肌缺血性損傷和肥厚性損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。為此，本研究從心肌細(xì)胞活性、凋亡率、凋亡蛋白表達(dá)水平及線粒體膜電位等幾個方面探討葡萄糖預(yù)處理是否可減輕高糖對心肌細(xì)胞的糖毒性損傷。

1 材料與方法

1.1 原代心肌細(xì)胞 新生2～3d SD乳鼠由廣東省動物實(shí)驗(yàn)中心提供，取乳鼠心臟用胰酶消化12h后，換用膠原酶消化心肌組織，提取細(xì)胞懸液。接種于100mm的培養(yǎng)皿中，在37℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)90min，成纖維細(xì)胞在90min內(nèi)已大部分貼壁，去除貼壁的成纖維細(xì)胞，再繼續(xù)用含BrdU(成纖維細(xì)胞抑制劑)的常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，再用不添加BrdU的常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)96h，即可培養(yǎng)出高純度的心肌細(xì)胞。原代心肌細(xì)胞總培養(yǎng)周期為6d。培養(yǎng)1d后顯微鏡下即可觀察到聚集交織成片、搏動的心肌細(xì)胞。

1.2 主要試劑 D-葡萄糖粉、BrdU(美國Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司)，MTS、TUNEL試劑(美國Promega公司)，JC-1試劑(中國碧云天公司)，抗體β-actin、Bcl-2、Bax、caspase-3、羊抗兔二抗(美國CST公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 ①用不同高糖濃度(5、10、25、50、75、100mmol/L)和葡萄糖預(yù)處理濃度(5、10、20、30、40、50mmol/L)培養(yǎng)心肌細(xì)胞，分析心肌細(xì)胞活性，明確最佳濃度建立高糖模型(HG)組和預(yù)處理(PG)組，最終選擇50mmol/L[10-11]和10mmol/L作為高糖處理和葡萄糖預(yù)處理濃度；②心肌細(xì)胞培養(yǎng)分組與時間線：對照組用常規(guī)培養(yǎng)基(DMEM，5mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)6d；高糖(HG)組用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，高糖(50mmol/L)培養(yǎng)96h；預(yù)處理(PG)組用高糖(50mmol/L)培養(yǎng)前，先用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，再用葡萄糖預(yù)處理(10mmol/L)4h，循環(huán)3次，每次間隔用含5mmol/L葡萄糖的DMEM處理4h。

1.4 MTS實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活性 根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)，細(xì)胞培養(yǎng)約6d后進(jìn)行MTS檢測。細(xì)胞濃度約為1×105個/ml，按照1:10比例加入MTS細(xì)胞活性檢測試劑，每孔總量100μl(即90μl常規(guī)培養(yǎng)基+10μl MTS檢測液)，每組重復(fù)5孔，操作過程避光。在37℃避光孵育4h后以酶標(biāo)儀讀取490nm處的吸光度(OD)值，檢測到的數(shù)值與活細(xì)胞數(shù)呈正比，正常對照組結(jié)果為0.8～1.2，保存并分析數(shù)據(jù)。

1.5 TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞接種于放有蓋玻片的6孔板中，建模后加入4%多聚甲醛中固定30min，PBS浸洗2次，每次5min；室溫條件下用0.2% Triton X-100液孵透膜和避光條件下用工作液孵育1h；最后在共聚焦顯微鏡觀察前24h內(nèi)進(jìn)行4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染10min，并用甘油與PBS比例為1:1的混合液防止猝滅進(jìn)行封片，置于4℃冰箱避光條件下保存。在熒光顯微鏡下，活細(xì)胞細(xì)胞核因DAPI呈現(xiàn)亮藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光，綠色熒光和藍(lán)色熒光的比值即為細(xì)胞的凋亡率。

1.6 JC-1染色法檢測線粒體膜電位 細(xì)胞接種于共聚焦皿中，每皿接種1ml細(xì)胞液，建模后加入JC-1染色工作液1ml，37℃孵育20min。孵育結(jié)束后，用JC-1 1×Buffer洗滌3次，每次5min，動作輕柔。然后用Hoechest 33342工作液室溫避光孵育5min，孵育結(jié)束后用PBS洗3次，每次2min，最后棄去PBS，加入2ml常規(guī)培養(yǎng)基，于激光共聚焦顯微鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)，紅色與綠色熒光的比值代表線粒體膜電位的損傷程度。

1.7 Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 電泳時恒壓跑膠，濃縮膠80V，分離膠100～120V，電泳時間為1～2h，觀察Marker蛋白條帶較徹底分離或溴酚藍(lán)將跑出膠外時，可終止電泳。轉(zhuǎn)膜時用恒流200mA，轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)目的蛋白的分子量設(shè)定，一般分子量等于分鐘數(shù)。轉(zhuǎn)膜后室溫封閉2h，敷一抗、二抗抗體，曝光。內(nèi)參不封閉直接漂洗3次曝光。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，均進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，則多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，若方差不齊時，組間比較采用Welch法進(jìn)行近似方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni或Dunnett's T3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 葡萄糖預(yù)處理對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性的影響 用不同的高糖濃度(5、10、25、50、75、100mmol/L)構(gòu)建高糖模型培養(yǎng)心肌細(xì)胞，MTS實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，高糖濃度達(dá)到50mmol/L時，與對照組(5mmol/L葡萄糖)比較，心肌細(xì)胞活性明顯降低(P＜0.05，圖1A)。用不同的葡萄糖預(yù)處理濃度(5、10、20、30、40、50mmol/L)在建立高糖模型前對心肌細(xì)胞預(yù)處理3次，分析心肌細(xì)胞活性，結(jié)果表明，與HG組比較，不同濃度的葡萄糖預(yù)處理均可增強(qiáng)心肌細(xì)胞活性，其中預(yù)處理濃度為10mmol/L時統(tǒng)計(jì)學(xué)差異最明顯(P＜0.05，圖1B)，因此以10mmol/L作為本實(shí)驗(yàn)的最佳葡萄糖預(yù)處理濃度。

2.2 葡萄糖預(yù)處理對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞線粒體損傷的影響 HG組紅/綠熒光比值明顯低于對照組，即HG組的線粒體膜電位ΔΨm較低，線粒體損傷較嚴(yán)重(P＜0.05)，PG組紅/綠熒光比值高于HG組，即PG組的線粒體膜電位ΔΨm明顯高于HG組(P＜0.05，圖2)，而PG組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 葡萄糖預(yù)處理對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色結(jié)果顯示，與對照組相比，HG組的心肌細(xì)胞凋亡率明顯增高(P＜0.01)，與HG組相比，PG組的心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低(P＜0.05，圖3)，而PG組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3的表達(dá)量 Western blotting檢測結(jié)果顯示，在內(nèi)參平齊的條件下，與對照組相比，HG組的Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，Bax和caspase-3蛋白的表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，而PG組的Bcl-2蛋白、Bax和caspase-3蛋白的表達(dá)與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；與HG組相比，PG組中Bcl-2蛋白的表達(dá)增多，Bax和caspase-3蛋白的表達(dá)有所減少(P＜0.05，圖4)。

圖1 葡萄糖預(yù)處理對心肌細(xì)胞活性及心肌細(xì)胞糖毒性損傷的影響(±s，n=5)Fig.1 Effects of glucose-pretreatment on the cardiomyocytes activity and the high glucose-induced toxicity on NRCs (±s, n=5)

圖2 葡萄糖預(yù)處理對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞線粒體膜電位ΔΨm的影響(n=3)Fig.2 Effect of glucose pretreatment on cardiomyocyte mitochondrial membrane potential ΔΨm (n=3)

圖3 熒光顯微鏡下觀察高糖預(yù)處理對心肌細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Fluorescence microscope images the effect of glucose pretreatment on cardiomyocyte apoptosis

圖4 高糖預(yù)處理對心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3表達(dá)水平的影響(Western blotting，n=3)Fig.4 Effect of glucose pretreatment on the expression of apoptosis-related proteins Bcl-2, Bax and caspase-3 (Western blotting, n=3)

3 討 論

高糖環(huán)境對心肌細(xì)胞的損傷是多方面的，但其具體機(jī)制尚不明確[12]。在本研究中，HG組糖毒性嚴(yán)重?fù)p傷心肌細(xì)胞活性，但這種損傷與滲透壓無關(guān)，因?yàn)?0mmol/L高糖環(huán)境對細(xì)胞的損傷，遠(yuǎn)高于相同濃度甘露醇的滲透壓作用對細(xì)胞活性的影響[10-11]。而10mmol/L葡萄糖預(yù)處理可增強(qiáng)心肌細(xì)胞活性，減輕心肌細(xì)胞糖毒性損傷。同時，葡萄糖預(yù)處理能夠減少高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。這與本課題組前期的研究結(jié)果一致，即高糖環(huán)境可增加心肌細(xì)胞凋亡[13]。本研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖預(yù)處理通過影響凋亡相關(guān)蛋白，即上調(diào)Bcl-2的表達(dá)水平，下調(diào)Bax、caspase-3的表達(dá)水平來減少高糖所致的心肌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的發(fā)生主要由兩個機(jī)制激活caspase通路[14]：外在通路激活caspase-8[15]或內(nèi)在通路激活caspase-9，其中內(nèi)在通路又稱為線粒體依賴通路[16]，這兩條通路均進(jìn)一步激活凋亡的執(zhí)行者caspase-3[17]。葡萄糖預(yù)處理能夠增強(qiáng)線粒體膜電位，減輕線粒體損傷。大量研究表明，線粒體易受高糖條件的不良影響，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)功能受損，進(jìn)而促進(jìn)活性氧(ROS)的過量產(chǎn)生[18]。ROS又反向加重線粒體損傷，使線粒體膜通透性增加，膜電位下降，Ca2+聚集，離子穩(wěn)態(tài)破壞，甚至激活相關(guān)調(diào)控基因觸發(fā)凋亡的內(nèi)在通路，損傷細(xì)胞核內(nèi)DNA，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[19]。本研究中，HG組caspase-3蛋白的表達(dá)量較對照組明顯增高，線粒體膜電位也明顯低于對照組；但PG組caspase-3蛋白的表達(dá)量明顯低于HG組，線粒體膜電位也明顯高于HG組，說明葡萄糖預(yù)處理對心肌細(xì)胞糖毒性損傷的保護(hù)機(jī)制涉及介導(dǎo)凋亡的內(nèi)在通路，即線粒體依賴通路。相似的是，某些降糖類藥物如利拉魯肽等也可通過降低血糖來減輕線粒體損傷，進(jìn)而減少凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞[20]。心肌缺血預(yù)處理能夠減輕心肌缺血性損傷，心肌肥厚預(yù)處理能夠增強(qiáng)心肌抗肥厚能力、減輕心肌肥厚性損傷[21-23]。筆者認(rèn)為葡萄糖預(yù)處理可能類似于心肌缺血或肥厚預(yù)適應(yīng)，對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用與細(xì)胞的適應(yīng)性和可塑性有密切關(guān)系[24-25]，本課題組也在繼續(xù)深入探究其具體機(jī)制。在臨床上，并不是所有疾病的控糖標(biāo)準(zhǔn)都是統(tǒng)一的，例如在保證不發(fā)生低血糖的條件下，腦卒中患者的血糖應(yīng)控制在7.8mmol/L以下，但是對于有嚴(yán)重心血管風(fēng)險的患者，血糖可考慮控制在10.2mmol/L以下[26]。因此，筆者認(rèn)為長期高糖對心肌細(xì)胞是有損害作用的，但是短期適當(dāng)濃度的葡萄糖預(yù)適應(yīng)對心肌細(xì)胞的長期發(fā)展是有益處的。

本課題作為發(fā)現(xiàn)性研究存在著一定的創(chuàng)新性與局限性：根據(jù)缺血預(yù)適應(yīng)、肥厚預(yù)適應(yīng)的概念，我們提出葡萄糖預(yù)適應(yīng)，同時證明了葡萄糖預(yù)適應(yīng)能夠減輕心肌細(xì)胞的高糖糖毒性損傷，對預(yù)適應(yīng)概念的擴(kuò)展具有一定的參考價值和啟發(fā)意義。但在細(xì)胞水平研究葡萄糖預(yù)處理對心肌細(xì)胞高糖損傷的作用與體內(nèi)環(huán)境存在一定的差異，本課題組也將繼續(xù)更加深入地研究。

綜上所述，本研究表明葡萄糖預(yù)處理在體外實(shí)驗(yàn)中能夠增強(qiáng)心肌細(xì)胞活性、減少細(xì)胞凋亡、減輕線粒體損傷，從而減輕高糖對心肌細(xì)胞的糖毒性損傷。